宮炎凈提取物中生物堿對(duì)子宮內(nèi)膜炎家兔的抗炎作用機(jī)理

賈書(shū)紅　李效振　張東升　等

摘要：為研究中藥復(fù)方宮炎凈提取物中生物堿對(duì)子宮內(nèi)膜炎家兔的抗炎作用機(jī)理，通過(guò)制備子宮內(nèi)膜炎家兔模型，給予不同劑量的生物堿治療后采血，分別對(duì)血液中超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）含量，白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，中藥復(fù)方宮炎凈中生物堿能顯著增強(qiáng)血清中SOD活性，并顯著或極顯著降低血清中MDA、NO、IL-2、IL-6及TNF-α含量（P<0.05或P<0.01）。以上結(jié)果表明，生物堿能降低子宮內(nèi)膜炎家兔脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，提高機(jī)體的抗氧化能力，降低機(jī)體炎性細(xì)胞因子含量，降低機(jī)體損傷。

關(guān)鍵詞：生物堿；家兔；子宮內(nèi)膜炎模型；抗炎機(jī)理

中圖分類號(hào)： S853.74文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0209-03

收稿日期：2014-03-24

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技支疆項(xiàng)目（編號(hào)：2013AB010）。

作者簡(jiǎn)介：賈書(shū)紅（1989—），女，河北石家莊人，碩士研究生，從事中草藥的開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：jiashuhong16@163.com。

通信作者：谷新利，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中草藥的開(kāi)發(fā)與利用研究。E-mail：xlgu@shzu.edu.cn。奶牛子宮內(nèi)膜炎是子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥的病理過(guò)程[1]，在臨床上治療該病大多依賴抗生素，而使用抗生素會(huì)帶來(lái)細(xì)菌耐藥性、藥物殘留等問(wèn)題，迫使人們?cè)絹?lái)越傾向使用中草藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎[2-4]。近年來(lái)，對(duì)于中草藥治療該病的報(bào)道較多，且對(duì)中草藥的抗炎作用也進(jìn)行了大量研究，但對(duì)中草藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的機(jī)理鮮有報(bào)道。研究人員依據(jù)中藥復(fù)方配方原則將益母草、五靈脂、紅花、肉桂等中藥組合研制開(kāi)發(fā)的中藥復(fù)方宮炎凈用于治療奶牛子宮內(nèi)膜炎，并在臨床上取得較好的治療效果[5]。本試驗(yàn)?zāi)康氖菑闹兴幙寡趸约皩?duì)細(xì)胞因子影響方面觀察中藥復(fù)方宮炎凈提取物中生物堿對(duì)子宮內(nèi)膜炎家兔模型血液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性以及細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)水平變化，旨在初步探討中藥復(fù)方宮炎凈提取物中生物抗炎作用機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物中藥復(fù)方宮炎凈主要有益母草、當(dāng)歸、川芎、桃仁、五靈脂、甘草等組成，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。中藥復(fù)方宮炎凈提取物：取中藥復(fù)方宮炎凈2 kg，加入10倍量70%乙醇浸泡24 h，裝柱，以2 mL/s的速度滲漉48 h，收集滲漉液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至生藥含量為1 g/mL。將制備好的宮炎凈提取液，用稀鹽酸調(diào)pH值4～5，抽濾，通過(guò)已處理好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，至流出液與10%硅鎢酸呈陽(yáng)性反應(yīng)為止。先用去離子水洗至流出液為近中性，再以5%鹽酸溶液洗脫至生物堿反應(yīng)為陰性。收集洗脫液，蒸干即得生物堿。將生物堿溶于蒸餾水中，配成質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的溶液。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物健康無(wú)生殖疾病的未孕新西蘭雌兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由石河子大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。家兔子宮內(nèi)膜炎模型制作[6]： 取30只新西蘭雌兔，飼喂1周后，隨機(jī)分組，其中5只作為正常對(duì)照組，其余25只作為試驗(yàn)組，試驗(yàn)組家兔子宮灌注大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的12 h培養(yǎng)物等比例混合菌液2 mL/（只·d），每天1次，連續(xù)4 d。通過(guò)觀察家兔臨床癥狀、體溫變化、子宮分泌物變化、白細(xì)胞分類變等確認(rèn)造模成功后用于試驗(yàn)。

1.1.3主要試劑與儀器地塞米松磷酸鈉注射液（1206091，河南潤(rùn)宏制藥有限公司）；冰醋酸為國(guó)產(chǎn)分析純；NO測(cè)試盒（硝酸還原酶法，20130824）、SOD測(cè)試盒（羥胺法，20130820）、MDA測(cè)試盒（硫代巴比妥酸法，20130823）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；IL-2、IL-6、PGE2與TNF-a ELISA測(cè)定試劑盒均購(gòu)于美國(guó)RD公司。 BioTek SynergeyTM 2多功能酶標(biāo)儀 （550，Bio-Rad）；TDL-5離心機(jī)（Z36 HK，上海安亭科學(xué)儀器廠）；電熱恒溫水浴箱（WB-3-2.0T，上海實(shí)貝儀器設(shè)備廠）；渦旋混勻器。

1.2方法

將25只造模成功的新西蘭母兔隨機(jī)分成5組，每組5只，分別為中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組和地塞米松組。中藥高中低3個(gè)劑量組分別給予生物堿（10、5、2.5 mL/只）；地塞米松組給予地塞米松，劑量為 5 mg/kg；模型組不予治療；正常對(duì)照組給予生理鹽水。給予頻率1次/d，連續(xù)7 d。

樣品采集和處理。各組家兔于末次給藥后，分別心臟采血約10 mL，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清于-20 ℃保存待用，用以SOD活性，MDA、NO、PGE2含量以及IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的測(cè)定。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1家兔SOD活性及MDA、NO、PGE2含量測(cè)定SOD活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法（TBA），NO含量的測(cè)定采用硝酸還原酶法，PGE2含量的測(cè)定采用雙抗體夾心法。嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定，并根據(jù)相應(yīng)計(jì)算公式計(jì)算出試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.2家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的測(cè)定IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的測(cè)定均采用雙抗夾心法。測(cè)定原理為雙抗體夾心法的基本原理，即利用特異性抗體包被微孔板，制成固相抗體，然后和待檢血清中相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后加酶標(biāo)抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)徹底洗滌后加底物顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1家兔血清中SOD活性以及MDA含量的測(cè)定

由表1可見(jiàn)，子宮內(nèi)膜炎家兔模型組血清中SOD的活性以及MDA的含量均極顯著低于空白對(duì)照組。生物堿高劑量組SOD活性極顯著強(qiáng)于模型組；生物堿中劑量組和低劑量組SOD活性均顯著強(qiáng)于模型組；生物堿高、中、低3個(gè)劑量組均與空白對(duì)照組差異不顯著，且均與地塞米松組差異不顯著；生物堿高、中、低3個(gè)劑量組間無(wú)顯著差異。而子宮內(nèi)膜炎家兔模型組血清中MDA含量除顯著高于生物堿低劑量組外，均與其他組差異極顯著。生物堿高、中、低3個(gè)不同劑量組MDA含量均與空白對(duì)照組差異不顯著，且均與地塞米松組差異不顯著。表明中藥復(fù)方宮炎凈中生物堿能顯著增強(qiáng)血清中SOD活性，降低MDA含量，提高機(jī)體抗氧化能力，降低機(jī)體損傷。

2.2家兔血清中NO、PGE2含量的測(cè)定

由表2可見(jiàn)，子宮內(nèi)膜炎家兔模型組血清中NO含量極顯著高于空白對(duì)照組；生物堿高劑量組和中劑量組NO含量均極顯著低于模型組，均與地塞米松組差異顯著，且均與空白對(duì)照組差異不顯著；生物堿低劑量組NO含量顯著高于生物堿高劑量組和中劑量組。而家兔血清中PGE2含量變化不明顯。表明生物堿能顯著降低子宮內(nèi)膜炎家兔血液中NO含量。

表1家兔血清中SOD活性以及MDA含量測(cè)定結(jié)果（n=5）

表2家兔血清中NO、PGE2含量測(cè)定結(jié)果（n=5）

組別NO含量

（μmol/L）PGE2含量

（ng/L）生物堿高劑量組58.07±0.52bBC347.62±17.12生物堿中劑量組61.93±7.98bBC385.79±22.53生物堿低劑量組83.45± 10.23aAC 360.43±21.82地塞米松組53.24±4.69bB364.63±19.60模型組92.69± 6.92aA 384.95±24.02空白對(duì)照組52.83±5.08bB377.11±16.87

2.3家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)水平測(cè)定

由表3可見(jiàn)，子宮內(nèi)膜炎家兔模型組的IL-2、IL-6、TNF-α含量與均極顯著高于空白對(duì)照組。生物堿高劑量組的IL-2與IL-6表達(dá)水平均與模型組差異極顯著，與地塞米松組差異不顯著，且與空白對(duì)照組差異不顯著；而生物堿中劑量組的IL-2與IL-6的表達(dá)水平均顯著低于模型組，且與空白對(duì)照組和地塞米松組差異不顯著；生物堿低劑量組 IL-2 與IL-6含量均與模型組差異不顯著；生物堿高、中、低3個(gè)劑量組之間均差異不顯著。模型組TNF-α的表達(dá)水平與生物堿低劑量組差異顯著，與其他各組均差異極顯著；生物堿高、中劑量組與地塞米松組均差異不顯著，且均與空白對(duì)照組均差異不顯著。生物堿高、中、低3個(gè)劑量組TNF-α水平的表達(dá)之間差異不顯著。表明生物堿能顯著降低血液中IL-2、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，且以生物堿高劑量組效果最好。表3家兔血清中IL-2、IL-6與TNF-α表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（n=5）

組別IL-2表達(dá)水平

3結(jié)論與討論

正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)抗氧化能力始終與機(jī)體清除自由基之間維持動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定保護(hù)機(jī)體組織不被損傷。近年研究結(jié)果表明，機(jī)體許多疾病如炎癥、自身免疫疾病等均與機(jī)體內(nèi)過(guò)量的氧自由基有關(guān)，即機(jī)體抗氧化能力下降或氧自由基產(chǎn)生過(guò)多則會(huì)引起組織損傷[7]。正常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基不僅無(wú)毒性作用，還具有獨(dú)特的生理作用，能殺滅有害微生物、消滅突變的細(xì)胞、解毒以及免疫調(diào)節(jié)等作用。但如果體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過(guò)多或機(jī)體清除氧自由基的能力降低之后，能引起氧自由基蓄積引起組織損傷。SOD在機(jī)體組織內(nèi)廣泛存在，是機(jī)體重要的抗氧化酶，能保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷，SOD活性間接反映機(jī)體清除自由基的能力。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終末代謝產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)MDA含量常可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化狀態(tài)，從而可以間接反映機(jī)體受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜炎家兔模型組血清中SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著升高；而中藥復(fù)方宮炎凈中生物堿能顯著增強(qiáng)血清中SOD活性，降低MDA含量。表明子宮內(nèi)有炎癥時(shí)機(jī)體MDA含量顯著升高，體內(nèi)氧化過(guò)程加劇自由基產(chǎn)生過(guò)多，此時(shí)SOD活性顯著減弱，機(jī)體抗氧化能力顯著下降，最終導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力與清除自由基之間動(dòng)態(tài)平衡被打破，引起機(jī)體損傷。而生物堿能提高機(jī)體抗氧化能力，降低機(jī)體損傷，這與郭宏斌等的報(bào)道[8-9]一致。

NO是一種具有不配對(duì)電子的自由基，能與超氧陰離子反應(yīng)生成強(qiáng)氧化性物質(zhì)—過(guò)氧化亞硝酸鹽，這種強(qiáng)氧化性物質(zhì)不僅具有毒性，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，而且還能進(jìn)一步產(chǎn)生多種毒性物質(zhì)，引發(fā)組織損傷，在炎癥的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起重要作用[10]。PGE2是花生四烯酰合成酶的代謝產(chǎn)物，由巨噬細(xì)胞分泌合成，是一種重要的炎性介質(zhì)，在局部炎癥和骨關(guān)節(jié)炎中研究較多[11-14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜炎家兔模型組血清中NO含量顯著升高，且生物堿能顯著降低血清中NO含量，而各組血清PGE2含量均變化不明顯。表明NO參與機(jī)體炎癥過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而生物堿能降低NO的生成，起到抗炎作用；PGE2可能在局部炎癥中生成會(huì)增多，但在子宮內(nèi)膜炎家兔血清中變化不顯著，說(shuō)明生物堿對(duì)家兔子宮內(nèi)膜炎的抗炎機(jī)理可能與抑制NO生產(chǎn)有關(guān)，與李曉紅等的研究結(jié)果[15-16]一致。

細(xì)胞因子主要是指由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞分泌的一類小分子多肽或蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子根據(jù)Th細(xì)胞亞群分泌特點(diǎn)將其劃分為2種：Th1型和Th2型細(xì)胞因子。前者主要包括IL-2、IFN-γ以及TNF-β，主要參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫；后者主要包括IL-4、IL-5、IL-6、IL8以及IL-10，參與體液介導(dǎo)免疫。在機(jī)體發(fā)生炎癥、變態(tài)反應(yīng)、休克或自身免疫疾病時(shí)，某些細(xì)胞因子的表達(dá)量會(huì)大量增加。 IL-2主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，活化巨噬細(xì)胞[17]，但在生殖免疫方面，因IL-2不利于胚胎生產(chǎn)，被認(rèn)為是有害的細(xì)胞因子。IL-6 是由多種淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，生物活性多種多樣，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其生物活性十分廣泛，對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及代謝具有重要的調(diào)節(jié)和介導(dǎo)作用。張冬波研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜炎的輕重程度與炎性細(xì)胞因子水平有關(guān)，奶牛發(fā)生子宮內(nèi)膜炎后，子宮內(nèi)膜炎組織中IL-2、IL-6、TNF-α的水平均高于正常奶牛[18]。趙廣興等用混合菌接種法制作慢性盆腔炎動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)模型輸卵管局部組織中IL-2 和 IL-6 水平顯著增高[19]。葉贊等通過(guò)建立大鼠產(chǎn)后子宮炎癥模型，發(fā)現(xiàn)模型組血清中TNF-α水平顯著升高，益母草能使血清中TNF-α水平顯著下降[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜炎家兔模型組血清中IL-2、IL-6與TNF-α表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，生物堿能顯著降低家兔血清中IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)水平，與上述報(bào)道一致。

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