中藥材天南星根腐病病原菌的分離與鑒定

袁孟娟　張薇　董慧鈞　等

摘要：采用組織分離法、梯度稀釋法分離并純化出天南星根腐病的致病菌，并進行病原菌致病性測定，通過形態學、分子生物學鑒定，確定天南星根腐病的主要致病菌是毛霉屬的卷枝毛霉。

關鍵詞：天南星；根腐病；毛霉

中圖分類號： S435.67文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0153-02

收稿日期：2014-02-25

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2013CQ019）；聊城大學博士科研啟動基金（編號：3010）。

作者簡介：袁孟娟（1990—），女，山東日照人，碩士研究生，主要從事生物制藥研究。E-mail：yuanmengjuan1990@163.com。

通信作者：陳芳，博士，副教授，主要從事微生物制藥研究。E-mail：chenfang20045@163.com。天南星是一種重要的中藥材，具有燥濕化痰、祛風止痙、散結消腫等功效，可用于治療頑痰咳嗽、風痰眩暈、中風痰壅、口眼歪斜、半身不遂、癲癇、驚風、破傷風等癥[1]。天南星根腐病是一種土傳病害，傳染性極強，一株植株出現病癥，臨近的植株大多會被傳染，天南星根腐病病菌主要靠水傳播，波及范圍廣，如果不注意防治，將造成較大損失。植株感染天南星根腐病病菌后，首先出現褐色斑點，周圍有黃色暈圈，最后葉片枯萎，植株死亡。根腐病對天南星產量、品質影響極大。本研究從山東省茌平縣杜郎口鎮中藥材種植基地采集天南星根腐病病株，用組織分離法對天南星根腐病原菌進行了分離純化與鑒定，觀察病原菌在PDA培養基上的培養性狀、孢子形狀，結合致病性測定及菌株分子生物學鑒定方法確定病原菌的種屬分類[2]，并且在天南星根際土壤中分離得到大量具有拮抗活性的有益微生物，利用這些拮抗微生物對天南星土傳病害進行生物防治，旨在為天南星根腐病的有效防治提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

天南星根腐病病株采自山東省茌平縣杜郎口鎮中藥材種植基地。

1.2病原菌分離方法

為降低腐生菌的干擾，以新鮮發病的植物組織作為分離材料，選取發病部位、健全部位之間（病健交界處）的組織進行分離[3]。取天南星根腐病株的塊莖，掰開后用鑷子刮取斷面上的發病組織，均勻涂布在制好的培養基上。采用組織分離法分離病原菌，從病株刮取適量組織，用5%NaOCl溶液消毒3 min，無菌水洗2～3次，用滅菌濾紙吸干，分別接種到LB培養基、PDA培養基上，于恒溫培養箱中25～28 ℃倒置培養5 d，觀察菌落生長狀況[4]。

1.3病原菌純化方法

在無菌條件下，從菌落邊緣部分挑取菌絲轉接到PDA培養基上25 ℃培養2 d，待菌絲長出后進行多次重復培養，確定培養皿中無其他雜菌后進行轉管，4 ℃冰箱保存。

1.4天南星根腐病病原菌Tnx的形態學鑒定

肉眼直接觀察病原菌在PDA培養基上的菌落形態、色澤等。選擇生長狀況良好的菌落挑取菌絲、孢子制成臨時裝片，在顯微鏡下觀察菌絲形態、有無孢子等。若有孢子則進一步觀察孢子形狀及多少、有無隔膜及隔膜數、產孢細胞類型、厚垣孢子的有無、子實體類型等，并測量孢子大小，對Tnx菌株進行形態學鑒定。

1.5天南星根腐病病原菌Tnx的分子生物學鑒定

用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA。采用引物 NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）、NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）對供試菌株基因組DNA進行PCR擴增。反應體系為：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，5×buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，F（10 μmol/L）0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL，并加ddH2O至25 μL。PCR循環條件：預變性（98 ℃，3 min）→變性（98 ℃，25 s）→退火（55 ℃，25 s）→延伸（72 ℃，1 min）→修復延伸（72 ℃，10 min）→終止反應（4 ℃，∞），30個循環。PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統檢測拍照記錄，得到目的條帶后，將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。用所獲菌株的rDNA-NS序列信息同GenBank中的序列信息進行同源性比對，確定病原菌的種類。

1.6天南星根腐病病原菌Tnx的致病性鑒定

采用根部切傷接種法接種，將分離的病原菌在PDA培養基上培養7 d，從培養基上刮取菌絲，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下用孢子計數器將孢子懸浮液濃度調至106個/mL接種健康植株根部，接種量為10 mL/株，每處理重復3次，設清水作為對照，定期觀察并記錄發病情況。接種植株出現癥狀后，比較其癥狀是否與田間癥狀一致，再次進行病原菌分離，比較分離前后得到的病原菌菌落形態、色澤、孢子等特征是否一致[5]。2結果與分析

2.1天南星根腐病病原菌Tnx的分離純化結果

分離純化得到的病原菌見圖1。

2.2天南星根腐病病原菌Tnx的形態學鑒定結果

天南星的根腐病原菌生長速度比其他病原真菌快，一般接種后1～2 d即可觀察到白色菌落，呈圓形，孢子長出后略呈黑色，孢子在顯微鏡下呈橢圓狀（圖2、圖3）。

2.3天南星根腐病病原菌Tnx的分子生物學鑒定

測序結果表明，天南星根腐病病原菌Tnx 18S rDNA為 1 354 bp，Blast比對結果表明，該序列與毛霉屬相似度達99%。

2.4天南星根腐病病原菌Tnx致病性鑒定

經根部切傷接種法接種的天南星植株表現出根腐病的一系列癥狀，與田間癥狀一致。從病組織上再次進行病原菌分離得到的病原菌與先前分離的病原菌菌落形態一致。對照組天南星植株不出現根腐病的癥狀，從其植株中分離不出根腐病病原菌（圖4、圖5）。

3結論

通過對天南星根腐病原菌病情調查，得知天南星根腐病是由真菌引起的一種土傳病害，近年來傳播蔓延較快，嚴重影響天南星的產量、質量。本研究對天南星根腐病原菌的分離到了一種病原菌Tnx，經過分子生物學18S rDNA鑒定，得知該病原菌為卷枝毛霉。

參考文獻：

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[2]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979：560-646.

[3]方中達. 植病研究方法[M]. 北京：農業出版社，1979：110-155.

[4]Uddin W，Knous T R. Fusarium apecies associated with crown rot of alfalfa in Nevada[J]. Plant Disease，1991，75（1）：51-55.

[5]Hietala A M，Sen R B，Lilja A. Anarnorphic and teleomorphic characteristics of a uninucleate Rhizoctonia solani isolated from the roots nursery gorwn conifer seedlings[J]. Mycological Research，1994，98（9）：1044-1050.孫華尊，李友軍，黃明，等. 豆麥輪作模式下保護性耕作對冬小麥田雜草群落的影響[J]. 江蘇農業科學，2015，43（1）：155-157.