MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗中的應用

戴穎欣，　李　敏

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科, 上海 200127)

MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗中的應用

戴穎欣，李敏

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科, 上海 200127)

摘要：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是一種軟電離質譜，適用于分析蛋白質等生物大分子物質，可用來繪制微生物的蛋白質圖譜，達到鑒定的目的。基于MALDI-TOF MS的蛋白質譜技術具有快速、準確、敏感性高、高通量等特點，目前已應用于細菌和真菌的鑒定，其在微生物耐藥性分析、分型和毒力研究等科研領域的應用也初有成效，尚有巨大的發展空間。本文就以MALDI-TOF MS為代表的蛋白質譜技術在微生物檢驗和科研中的應用作一綜述。

關鍵詞：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；微生物；檢驗；科研

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0102-06R446.5

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.002

Abstract:Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is one kind of soft ionization mass spectrometry, which is suitable for the analysis of bio-macromolecule, such as protein. It can be used for microbial identification by mapping the microbial protein mass spectra. Since MALDI-TOF MS technology is well-known for its rapidity, accuracy, high sensitivity and high throughput, it has been applied in bacterium and fungus identifications. MALDI-TOF MS also has a good performance in the field of scientific research, including resistance analysis, bacterium typing and virulence study，and there is still a large space for development. In this paper, we reviewed the application of MALDI-TOF MS technology in microbial identification and scientific research.

基金項目：國家自然基金資助項目(81322025、81171623、81371875)；上海市衛生系統優秀青年人才計劃(XYQ2011039)；上海市曙光人才計劃項目(12SG03)

作者簡介：戴穎欣，女，1992年生，碩士，主要從事病原微生物致病機制研究。

通訊作者：李敏，聯系電話：021-68383297。

收稿日期：(2014-10-24)

Application of MALDI-TOF MS technology in clinical microbial determinationDAIYingxin,LIMin.(DepartmentofClinicalLaboratory,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry; Microbiology; Determination; Scientific research

病原微生物引起的感染性疾病嚴重威脅著人類健康，近年來隨著抗菌藥物濫用導致多種細菌耐藥以及部分新型細菌的出現使形勢更加嚴峻。傳統的微生物鑒定方法主要是基于表型的檢測，包括革蘭染色、微生物培養和生化試驗等，因時間較長、鑒定范圍窄，影響了病原微生物鑒定的速度和準確性，在一定程度上阻礙了感染性疾病的控制。因此，臨床上急需快速而準確的病原微生物鑒定方法以改善感染性疾病患者療效。近年來質譜技術發展迅猛，其中基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)作為蛋白質組學研究的支柱技術，在推動微生物蛋白組學發展的同時，也為基于蛋白質指紋圖譜的微生物鑒定奠定了基礎。MALDI-TOF MS是一種新興的軟電離質譜，用于繪制微生物的蛋白質譜峰圖譜，將臨床微生物的質譜數據與已知微生物的標準蛋白指紋圖譜數據庫進行比較，達到鑒定的目的。由于其具有快速、準確、靈敏、自動化及高通量等特點，MALDI-TOF MS已成為一項高效的微生物快速鑒定技術被用于歐洲的臨床微生物實驗室，并將逐步取代常規的檢測方法。本文就以MALDI-TOF MS為代表的蛋白質譜技術在微生物檢驗和科研中的應用作一綜述。

一、MADLI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要由三部分組成：(1)樣本解析/電離室；(2)飛行時間質譜分析器；(3)粒子探測器[1]。MALDI-TOF MS的基本原理是將微生物樣本與等量的基質溶液混合或分別點加在樣品靶盤上，溶劑揮發后形成樣本與基質的共結晶；利用激光作為能量來源輻射結晶體，基質從激光中吸收能量使樣本吸附，基質與樣本之間發生電荷轉移使得樣本分子電離；樣本離子在加速電場下獲得相同的動能，經高壓加速、聚焦后進入飛行時間質譜分析器進行質量分析，將檢測到的離子峰為縱坐標，離子質荷比(m/z)為橫坐標，形成質量圖譜，通過軟件分析比較，篩選并確定出特異性指紋圖譜，從而實現對目標微生物種或菌株的區分和鑒定。MALDI-TOF MS可用于分析多種類型的樣本，包括有機分子溶液、核酸、蛋白質以及整個微生物，其中蛋白質和微生物是目前在臨床微生物實驗室應用最廣的項目[2]。

二、MADLI-TOF MS在微生物鑒定中的應用

MADLI-TOF MS是一種軟電離技術，特別適用于分析蛋白質、多肽等生物大分子物質。它可以直接分析完整的蛋白質分子而不需要進一步粉碎，正是這一特點使其在分析完整微生物的蛋白質譜方面具有很大的優勢[1]。由于所得到的蛋白質圖譜中主要的分子離子峰為菌體內高豐度、表達穩定且進化保守的核糖體蛋白，因此，其鑒定結果穩定、可靠。用于微生物鑒定的樣本既可以是分離培養的純菌落，也可以是原始的臨床樣本[3]。樣本可以濃縮、純化或是進行一些預處理以提純蛋白，也可以不經任何處理直接用于檢測[1]。常規的臨床微生物檢測往往需要對大量不同的樣本進行鑒定，這對MADLI-TOF MS的準確度和工作效率提出了挑戰，目前已有許多研究對MADLI-TOF MS的臨床應用價值進行了評估。

(一)MADLI-TOF MS對細菌的鑒定

SENG等[4]使用MADLI-TOF MS和常規方法鑒定來自臨床的1 660個菌株，用16S rRNA測序補充鑒定不明確的菌株。結果顯示 MADLI-TOF MS準確鑒定了95.4%的菌株，其中84.1%鑒定到種的水平，11.3%鑒定到屬的水平，一開始未能鑒定的菌株在其蛋白質圖譜數據得到補充后也鑒定正確。MADLI-TOF MS被VAN VEEN等[5]用于臨床樣本的高通量檢測和前瞻性驗證研究，他們首先用MADLI-TOF MS鑒定327個已知菌株，在菌屬水平上得到95.1%的正確率，隨后對980個臨床菌株進行MADLI-TOF MS和常規生化系統的平行試驗，結果兩者在菌種水平上鑒定的正確率分別為92.2%和83.1%，證實了MADLI-TOF MS在鑒定菌種的準確性上優于常規生化系統。

除了對大量隨機樣本進行檢測以外，部分研究還分別對不同種類的細菌進行了鑒定。其中，革蘭陽性球菌主要以葡萄球菌和鏈球菌為代表。DUBOIS等[6]用MADLI-TOF MS對包含22種葡萄球菌的152個菌株進行了鑒定，其中99.3%(151/152)鑒定到種的水平。在近期一項研究中，Vitek MS v2.0 system (MALDI-TOF MS)從非肺炎鏈球菌種群中準確地區分出了肺炎鏈球菌，116株非肺炎鏈球菌中只有1株(<1%)被錯判[7]。MALDI-TOF MS為這些具有挑戰性的微生物鑒定提供了一種快速而簡便的方法。臨床上常見的革蘭陰性桿菌主要包括腸桿菌和非發酵菌。HE等[8]使用基于MADLI-TOF MS的Biotyper system對從605份糞便樣本中選出的304個可疑菌落進行了鑒定，其中包含22株沙門菌、39株志賀菌、3株腸出血性大腸埃希菌、2株小腸結腸耶爾森菌、2株彎曲菌和236株胃腸道正常菌群菌株。該系統正確鑒定出了沙門菌、小腸結腸耶爾森菌和彎曲菌，但是由于志賀菌、腸出血性大腸埃希菌和大腸埃希菌三者的特征性質譜高度相似，它們并未被準確鑒別。236株腸道正常菌群菌中，233株(98.7%)和228株(96.6%)分別鑒定到屬和種的水平。值得一提的是，該研究的對象都是直接挑選自選擇培養基上的可疑菌落，并未經過純化，這將常規2~3 d的鑒定周期縮短到了孵育后的24 h內，由此表明Biotyper system可以作為篩選工具直接用于鑒定原始選擇培養基上的菌落。除了腸桿菌科細菌外，非發酵菌由于其較低的生化反應活性和不同的形態，在使用常規表型方法檢測時常常產生錯誤的鑒定結果。 DEGAND等[9]使用MADLI-TOF MS對非發酵菌進行了鑒定，先用包含多個菌種的一系列參考菌株的蛋白質譜作為基礎建立非發酵菌的圖譜數據庫，再分別對臨床的非發酵菌進行鑒定，得到了較高的準確率。此外，為了推動MADLI-TOF MS在臨床微生物實驗室的普及，MELLMANN等[10]還聯合8個實驗室對MADLI-TOF MS在非發酵菌鑒定方面的室間重復性進行了驗證。8個實驗室分別對60株秘密編碼的非發酵菌進行檢測，最終得到98.75%的室間重復性。

分枝桿菌的鑒定是臨床微生物檢測的重要部分，但是由于不同的菌種生長時間不同，加上其嚴苛的生長條件、較長的培養周期和較低的生長率，使分枝桿菌的鑒定成為臨床微生物檢測的一大難題。雖然分子探針和DNA雜交技術等相對快速而簡便，但也因為只針對有限的幾種分枝桿菌而使其應用受到限制。最近已有研究將MADLI-TOF MS運用于分枝桿菌的鑒定。NIITSUMA等[11]使用MADLI-TOF MS對臨床分離的158株結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC)和37株非結核分枝桿菌(nontuberculousMycobacteria，NTM)進行了鑒定，鑒定結果顯示MTC在種和屬的水平上準確率分別達到94.9%和99.4%，NTM在屬的水平上準確率達到了94.6%。周昭彥等[12]則對15株臨床分離株和68株環境分離株NTM進行了鑒定，通過比較3種樣本前處理和蛋白抽提方案建立了MADLI-TOF MS快速鑒定NTM的方法并進行了評價。

此外，MADLI-TOF MS還為一些特殊的、難鑒定的、甚至是新型的重組細菌提供了一條新的檢測思路。如以脆弱擬桿菌為代表的厭氧菌，常涉及不同來源的混合感染，而脆弱擬桿菌群的分離株表型十分相似，加上生長速度遠較需氧菌慢，常規和自動化的表型方法經常將其誤判。NAGY 等[13]對277株擬桿菌屬臨床分離株進行鑒定，有270株(97.5%)被明確鑒定，其中23株的結果有別于表型鑒定方法，11株經測序后證實了MADLI-TOF MS的正確性。而XIAO等[14]則運用MADLI-TOF MS在重組細菌的鑒定中進行了大膽嘗試，提出MADLI-TOF MS不僅可以作為鑒定重組細菌的一種快速、準確、高通量的方法，還為突變菌株甚至生物恐怖細菌的鑒定提供了新的可能。

(二)MADLI-TOF MS對真菌的鑒定

臨床上由機會致病菌引起的侵襲性真菌感染逐漸增多，尤其是在免疫力低下的患者中，這是引起高發病率和病死率的重要原因。由于傳統的生化方法不僅耗時而且需要相當的專業知識，因此臨床上迫切需要快速、可靠的方法來鑒定真菌和輔助抗真菌藥物的治療。MARKLEIN等[15]對臨床分離的267株真菌(包括250株念珠菌和其他的隱球菌、酵母菌、毛孢子菌等)分別用MADLI-TOF MS、常規表型及生化方法進行了鑒定。結果顯示，MADLI-TOF MS準確鑒定了247株(92.5%),剩余的20株真菌在參考數據庫得到補充后均被準確鑒定，整個實驗沒有假陽性存在。STEVENSON等[16]對MADLI-TOF MS用于臨床重要酵母菌種的快速鑒定進行了評估，他們創建了參考酵母菌株的圖譜數據庫(包括8個屬44種)，并對194個(含6屬23種)臨床菌株進行鑒定以測試數據庫的準確性，其中192個(99.0%)菌株被MADLI-TOF MS準確鑒定。除了單一的評價MADLI-TOF MS在真菌鑒定中的作用，ZHANG等[17]使用基于MADLI-TOF MS的Vitek MS System和以核糖體DNA測序為選擇性補充，作為侵襲性真菌監測的參考方法。該研究選取2011年中國醫院侵襲性真菌監測網絡上患有侵襲性真菌感染的患者作為樣本來源，共收集到1 243株菌株(代表31種酵母菌)用于分析，Vitek MS v2.0 system的鑒定結果與內部轉錄間隔(internal transcribed spacer，ITS)區序列分析(酵母菌鑒定的金標準)進行比較。經Vitek MS v2.0 system鑒定，96.7%的菌株準確鑒定到種的水平，0.2%鑒定到屬的水平，而2.4%和0.7%的菌株分別未能鑒定和被錯判。經重復測試后，菌種水平上的準確率達到97.3%。在此基礎上，結合Vitek MS system和核糖體DNA測序，99.7%的菌株得以準確鑒定，這為真菌感染監控的戰略計劃提供了切實可行的方法。

(三)MADLI-TOF MS對臨床樣本的直接鑒定

MADLI-TOF MS在微生物鑒定中的優勢除了其本身具有的快速、準確等特點外，還體現在可檢測樣本的多樣性，除了臨床分離得到的菌株，還可以直接用于原始樣本的檢測，其中以陽性血培養和尿液樣本為主要代表。

快速的病原菌檢測對于血流感染的診斷和治療有著極其重要的臨床價值。血培養和鑒定是菌血癥病原學診斷的金標準，而目前微生物實驗室血培養和鑒定需要較長時間孵育，報告結果時間長，遠不能滿足臨床對血流感染快速診斷的需要，MADLI-TOF MS有望解決這一問題。LA SCOLA 等[18]采用MADLI-TOF MS對陽性血培養瓶中的細菌直接進行鑒定，結果顯示由自動化系統鑒定為陽性并且只含一種細菌的562個血培養樣本中，370個(66%)被準確鑒定，未能鑒定的樣本大多數都是草綠色鏈球菌。而在另外22個含有2種或2種以上菌種的陽性血培養樣本中，只有1個菌種被鑒定正確。其它的研究也指出陽性血培養樣本在直接鑒定中存在問題，一是草綠色鏈球菌與肺炎鏈球菌不易鑒別，還有混合菌血培養樣本難以鑒定或容易錯判[19]。此外，在MADLI-TOF MS直接鑒定陽性血培養樣本的一些報道中有數據提示，MADLI-TOF MS的準確鑒定需要細菌濃度達到一定的標準(>107/mL)[20]。

尿培養是臨床上診斷尿路感染的“金標準”，因為其可以同時兼顧病原體的鑒定和定量。但這種方法往往時間長并且成本較高，為了縮短時間和降低成本，FERREIRA等[3]將MADLI-TOF MS用于臨床尿液樣本的直接鑒定，樣本處理只需要2次離心分別除去白細胞和收集細菌，簡便易行。結果表明MADLI-TOF MS可以在短時間內高度準確地鑒定感染性尿液樣本，并且針對有較高菌量計數(>105CFU/mL)的革蘭陰性菌樣本效果顯著。

三、MADLI-TOF MS在科研中的應用

MADLI-TOF MS不僅在臨床微生物鑒定中發揮著重要的作用，而且在微生物科研領域也有很大的應用前景。

(一)用MADLI-TOF MS進行細菌耐藥性分析

MADLI-TOF MS可以用來快速檢測抗菌藥物的耐藥性。近年來甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus，MSSA)的鑒別診斷對于臨床治療是一個很大的挑戰。已有部分研究將MADLI-TOF MS用于鑒定MRSA，有實驗發現MRSA和MSSA在500～3 500 m/z范圍內的質譜存在差異[21-22]，并且質譜圖譜準確地分為2個單獨的組(即MRSA和MSSA)[22]。而隨著頭孢菌素類抗菌藥物的廣泛使用，我國腸桿菌科細菌產超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)的比率居高不下，探索快速檢測革蘭陰性桿菌耐藥性的方法十分重要。CAMARA等[23]使用MADLI-TOF MS鑒定野生型和氨芐西林耐藥的大腸埃希菌，結果檢測到氨芐西林耐藥的大腸埃希菌約在29 000 m/z處有一個特異性峰值，最后證實該峰值對應β-內酰胺酶。近兩年，MADLI-TOF MS也開始用于革蘭陰性桿菌β-內酰胺酶尤其是碳青霉烯酶的檢測[24]。除了細菌的耐藥性相關檢測，MARINACH等[25]將MADLI-TOF MS的應用拓展到一項新的方法用作白念珠菌的藥物敏感性試驗，該試驗通過分析白念珠菌在不同濃度的氟康唑下蛋白圖譜的變化來檢測其對氟康唑的敏感性，結果顯示蛋白圖譜發生明顯改變的最低藥物濃度(minimal profile change concentration，MPCC)與美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的參考方法得到的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值高度一致。

(二)用MADLI-TOF MS進行分型和毒力研究

細菌種類繁多，且同種細菌常常有多種血清型，不同型別的細菌其生理生化特性可能存在明顯差異，致病性等方面也可能完全不同。因此，對同一種細菌進行快速分型是臨床微生物研究的一項重要課題。由于質譜圖具有菌株特異性，MADLI-TOF MS可用于細菌的分型。WOLTERS 等[26]對MRSA菌株的質譜圖進行分級聚類分析，發現MADLI-TOF MS分型結果與spa分型結果有很好的一致性。近期還有研究表明，MADLI-TOF MS可用于區分攜帶vanB基因的萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)與萬古霉素敏感株，提示其在VRE分型中的潛在作用[27]。而MALDI-TOF MS對沙門菌、大腸埃希菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌等多血清型細菌進行鑒定和分類也得到了初步應用,在沙門菌分型中表現出較好的分型能力。但是，由于目前MADLI-TOF MS在微生物分型方面尚未規范化和普及，因此還有很大的研發空間。與此同時，對于臨床上所關注的細菌毒力問題，MADLI-TOF MS也有少部分涉及。殺白細胞素(panton-valentine leukocidin，PVL)是金黃色葡萄球菌中一種典型的毒力因子 ，BITTAR等[28]在研究中發現帶有PVL的金黃色葡萄球菌有特異性的4 448 m/z峰,而PVL陰性的金黃色葡萄球菌無此峰,用該方法可快速檢測PVL陽性的金黃色葡萄球菌,檢測的敏感性可達100.0%,特異性達90.6%。

(三)用MADLI-TOF MS分析潛在的生物標志物

除了在微生物耐藥性分析、分型以及毒力等方面的應用外，MADLI-TOF MS還可用于分析細菌或疾病中存在的生物標志物。近期一項研究借助MADLI-TOF MS發現了MRSA和萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(vancomycin-intermediateStaphylococcusaureus，VISA)的1 774.1 m/z和1 792.1 m/z 2個峰，它們所對應的2種多肽存在于絕大部分社區獲得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)中，而醫院獲得性MRSA(hosiptal-acquired MRSA，HA-MRSA)中則幾乎沒有，所以這2個多肽可作為區分CA-MRSA和HA-MRSA的生物標志物[29]。

四、總結和展望

以MADLI-TOF MS為代表的蛋白質譜技術具有快速、準確、靈敏、高通量等特點，加上其自動化和低消耗的優勢而逐漸在臨床微生物實驗室被推廣，并且有望在不久的將來取代傳統的微生物鑒定方法。但是，現階段MADLI-TOF MS在微生物鑒定中還存在一定的局限性，如微生物蛋白指紋圖譜數據庫不夠完善，一些罕見菌種或新型細菌的圖譜尚未被現有數據庫收錄，從而導致鑒定困難；含有混合菌種的血培養樣本難以準確鑒別；同一菌屬中相近的菌種容易錯誤鑒定；直接鑒定時，血培養和尿液樣本中菌量對鑒定的影響；以及各臨床實驗室間由于培養習慣(培養基、培養時間、培養溫度等)的差異對實驗重復性的影響，這些問題都亟待解決。或許我們可以通過完善數據庫、規范微生物的前處理、建立標準的檢測流程提高準確性，還可以與部分常規方法相結合，最大程度上發揮蛋白質譜技術的作用。與此同時，MADLI-TOF MS已在微生物相關研究中嶄露頭角，它在今后的科研應用中還有很大的提升空間，有望在微生物耐藥機制研究、細菌毒力因子研究、亞型分型等方面發揮更大的效用。隨著蛋白質譜技術的不斷發展，相信在不久的將來，它一定會成為微生物鑒定和科研領域的一大支柱。

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(本文編輯：姜敏)