腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的研究進展

黃維真 綜述,潘新年 審校

(廣西壯族自治區婦幼保健院/婦產醫院/兒童醫院，南寧 530021)

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腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的研究進展

黃維真 綜述,潘新年 審校

(廣西壯族自治區婦幼保健院/婦產醫院/兒童醫院，南寧 530021)

碳青霉烯酶； 腸桿菌科細菌； 檢測方法

碳青霉烯類抗菌藥物是抗菌譜廣、抗菌活性強、殺菌作用快的β-內酰胺類藥物，其良好的細胞通透性、高度的酶穩定性及較低的毒性等特點已成為目前臨床治療嚴重細菌感染最主要的抗菌藥物之一，但是隨著碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的腸桿菌科細菌的出現及不斷的增多，該類藥物的臨床應用受到了嚴峻的挑戰。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制是產碳青霉烯酶。因此，快速、準確地檢測產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌，對于預防和控制產酶菌株的傳播具有重要意義?，F就實驗室檢測腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的研究進展作一綜述。

1 產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的篩查(表型篩查試驗)

準確檢測腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性是篩選產酶菌株的關鍵，試驗方法及底物選擇影響產酶菌株的篩選。Anderson等[1]以blaKPC基因作為金標準，采用亞胺培南、美羅培南、厄他培南對微量肉湯稀釋法、E-test法、平板稀釋法、Microscan Autoscan、Vitek-2等方法作比較，微量肉湯稀釋法對3種抗菌藥物敏感性大于90%，能較好檢測出細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性。不同實驗底物對產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌篩查的敏感性、特異性各不相同，Landman等[2]研究報道，以厄他培南作底物的肉湯稀釋法、E-test法、平板稀釋法、自動化儀器法敏感性大于90%,為最高，但特異性低于亞胺培南和美羅培南，提示厄他培南應該作為藥物敏感性試驗檢測最佳底物。近期有研究顯示，菌株對厄他培南的敏感性下降是產 KPC酶的敏感標志[3]。2010 年美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)對腸桿菌科細菌碳青霉烯類藥物折點進行了修訂，耐藥范圍能更好地覆蓋最小抑菌濃度(MIC) 值較低的產酶菌株。然而，篩查范圍過寬會造成高產AmpC 或產 CTX-M 型 ESBLs 合并外膜通道蛋白缺失菌株非特異的假陽性[4]。由于碳青霉烯酶耐藥異質性，至今尚未有對所有產碳青霉烯酶腸桿菌表型檢測的公認和CLSI等國際權威機構推薦的方法。因此，對碳青霉烯酶的篩查需要敏感性更高的檢測方法。

2 表型確認試驗

2.1 改良Hodge(MTH) MTH是CLSI推薦的用于檢測碳青霉烯酶表型的確認試驗。CLSI根據美國大量腸桿菌科分離菌株進行試驗，MTH檢測這些分離菌株中的KPC，敏感度和特異度均大于90%。MTH在篩選產金屬β-內酰胺酶細菌時敏感性低、特異性差、周期長，對低水平金屬β-內酰胺酶的敏感性和特異性有待評估。MTH不能區分碳青霉烯酶類型，其他耐藥機制(如CTX-M、AmpC)存在時也可能出現25%的假陽性。Fernando 等[5]設計在MHT加入苯硼酸和苯唑西林進行改良MTH，改良后MHT對A類碳青霉烯酶檢測的靈敏度和特異性更高(>90%,100%),通過不同圖形可將產KPC、GES、SME、IMI、NMC A類碳青霉烯酶與ESBLs、AmpC、MBLs、非A類碳青霉烯酶區分開來。

2.2 紙片增效試驗 碳青霉烯類抗菌藥物加上酶抑制劑紙片增效試驗常作為檢測金屬β-內酰胺酶(MBL)的方法，根據乙二胺四乙酸(EDTA)抑制MBL特性的E-test試條作為檢測MBL建議的方法，但是由于E-test試紙條成本較高，其他β-內酰胺酶耐藥機制和膜孔蛋白缺失或高度表達影響MIC的結果[6]。一種包含美羅培南聯合抑制劑EDTA、吡啶二羧酸、氨基苯硼酸、氯唑西林碳青霉烯酶檢測的試驗，可檢測出KPC、VIM、IPM、OXA和碳青霉烯類耐藥腸桿菌伴膜孔蛋白缺失ESBL、AmpC[7]。利用苯硼酸對KPC的高敏感度，合并AmpC和膜孔蛋白缺失也可檢出，與KPC不同，氯唑西林對AmpC和膜孔蛋白有協調作用。EDTA、吡啶二羧酸擁有較高的靈敏度檢測產金屬酶肺炎克雷伯菌，EDTA特異性較差，少量ESBL、KPC、OX-48也可出現陽性，但吡啶二羧酸特異性較強，只有MBL出現陽性，ESBL、KPC、OX-48都為陰性。Emilie 等[8]報道拉氧頭孢+EDTA協同試驗檢測MBL，拉氧頭孢高水平水解質粒介導的金屬β-內酰胺酶，但對絲氨酸碳青霉烯酶水解能力偏弱，拉氧頭孢對所有MBL(包括IPM、VIM等)都耐藥(<23 mm),EDTA能增強拉氧頭孢抑菌圈直徑(≥10 mm)。拉氧頭孢敏感試驗作為常規抗菌試驗，用于敏感篩選MBL甚至低產MBL的方法。拉氧頭孢+EDTA協同試驗用于不同MBL及膜孔蛋白改變的確認，方法簡單、經濟、結果易于觀察，適合于臨床微生物實驗室常規檢驗。

3 培養法

通過選擇性的在顯色培養基中加入碳青霉烯類抗菌藥物篩選產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌。Panagea等[9]比較CHROMagar KPC與加亞胺培南麥康凱培養基篩選產碳青霉烯酶腸桿菌的檢測結果,其陽性和陰性預測值分別為CHROMagar 100.0%和98.8%，亞胺培南麥康凱培養基94.7%和88.6%。盡管bla(KPC)和bla(VIM)在CHROMagar上無法從顏色或菌落形態進行區分，但CHROMagar KPC是一個有效的篩選培養基，適用于糞便中篩選各種產碳青霉烯酶腸桿菌科。一種包含厄他培南、氯唑西林、硫酸鋅的培養基(SUPERCARBA)能篩選出(除OXA-163外)OXA-48、NDM、VIM、IMP 和KPC腸桿菌科細菌，(1～3)×10 cfu/100 mg的濃度就能檢出，敏感性比ChromID ESBL (bioMérieux)和CHROMagar KPC (CHROMagar)都高[10]。SUPERCARBA培養基能有效提高檢測產碳青霉烯酶(多數常見類型)腸桿菌的能力，更廣范圍檢測產碳青霉烯酶任何類型。ID Carba是一種新顯色培養基，在檢測NDM-1比Colorex KPC更敏感,有可能作為篩查NDM-1的篩選培養基[11]。

4 生物化學方法

4.1 Carba NP test[12]Patrice Nordmann研發了Carba NP test，采用細菌細胞裂解后的酶粗提物與亞胺培南進行反應，碳青霉烯酶能水解碳青酶烯類抗菌藥物，使其開環伴H+產生，一定濃度H+可使檢測液中的酚紅指示劑變色，根據顏色變化進行判斷，推測菌株是否產碳青霉烯酶，根據不同酶抑制劑進一步確定產碳青霉烯酶菌株的組別。通過生化反應能較好區分碳青霉烯類耐藥菌株的耐藥機制。Carba NP對大多數產碳青霉烯酶細菌在15～30 min可檢出，Carba NP 100% 的OXA-48、KPC、IMP能被檢出(無論非選擇培養基還是選擇培養基)，VIM、NDM只能從補充鋅Mueller-Hinton瓊脂被檢出。Dortet等[13]研究表明鋅離子濃度是Carba NP檢測VIM、NDM-1的關鍵。Carba NP 還可用于直接檢測血培養細菌、培養基上生長菌落及臨床標本，但陽性、陰性預測值有待評估。該試驗與分子生物學技術比較，敏感性、特異性均為100%，2 h可獲得結果，經濟實用且不需要其他技術，可在醫院微生物實驗室日常實施。

4.2 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)方法[14]將細菌菌液加入到含美羅培南十二烷基硫酸鈉Tris-Hcl-Nacl緩沖液中，35 ℃孵育2 h，1 μL上清液與1 μL二甲基苯甲酸混合后進行MALDI-TOFMS檢測，產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌由于可以水解美羅培南出現358.5、380.5 m/z質譜峰，不出現384.5、406.5 M/Z質譜峰，非產碳青霉烯酶細菌則相反，通過質譜峰的變化可以鑒定產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌。MALDI-TOFMS法與PCR、測序法、分光光譜測量法結果高度一致，無假陽性、假陰性結果。該法可快速、準確直接檢測酶活性，其不僅可以作為鑒定依據還可以用于耐藥機制分析，但是要注意標本晾干后立即用質譜儀測定，如耽擱1 h后會引起美羅培南降解而變異。

4.3 二氧化硅磁珠法[15]用二氧化硅磁珠快速裂解產碳青霉烯酶細菌，檢測提取物對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶水解活性，根據酶底物特異性和EDTA、克拉維酸抑制不同碳青霉烯酶的特點，快速區分絲氨酸碳青霉烯酶和金屬碳青霉烯酶。

4.4 分光光度計法 分光光度計檢測碳青霉烯酶的水解作用是檢測可疑菌株碳青霉烯酶產生的參考方法。分別檢測細菌粗提物或部分純化酶加抑制劑和不加抑制劑，對碳青霉烯類藥物水解前后的吸光度，檢測酶的活性。這種方法能夠獲取酶型，但必須在參考實驗室進行。

5 免疫層析法[16]

根據金屬酶抗原表位的單克隆抗體建立免疫層析法可以直接檢測碳青霉烯類不敏感的IPM β-內酰胺酶腸桿菌和非發酵菌，免疫層析法直接檢測 IMP-MBLs(包括IMP-1、-2、-6、-7、-10、-11、-19、-20、-22、-40、-41、-42新型),IMP-MBLs通過與雙紙片增效試驗、MBL E-test、MTH比較，PCR證實，敏感性、特異性均為100%，有關試驗結果表明,對于 IMP-MBLs免疫層析法有可能替代PCR。

6 分子生物學方法

6.1 PCR法 包括普通PCR、多重PCR、實時PCR、分子信標多重實時PCR，PCR技術采用基因特異性引物進行PCR擴增及基因測序，可以檢測細菌是否具有碳青霉烯酶基因，多重PCR技術通過在1個反應體系中加入多對特異引物可以在1次反應中檢測多種目的基因。van der Zee等[17]采用多重實時PCR準確、快速地檢測Carbapenemases bla OXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaKPC,而且適用于篩選肉湯培養或直腸拭子和臨床標本。實時熒光定量PCR用熒光定量探針對所有blaKPC進行擴增，陽性擴增產物被BstNⅠ和RsaⅠ進行酶切消化分析以區分blaKPC1-3型基因。分子信標多重實時PCR根據熒光強度和熒光類型能檢測出blaKPC-2～blaKPC-11,有學者報道用分子信標多重實時PCR可檢測NDM-1基因。與常規PCR相比較，分子信標多重實時PCR可以進行閉管操作，有效消除核酸交叉污染，具有實時、定量、高靈敏度、高特異性特點。在臨床應用中PCR 法是檢測碳青霉烯酶基因的金標準，但是由于需要特殊儀器設備，費用昂貴，不適合臨床實驗室開展，另外其也無法檢測細菌大量耐藥的機制和碳青霉烯類耐藥的其他機制。

6.2 核酸微陣列法[18]PCR是最廣泛使用的分子技術，然而這些方法仍然耗時。核酸微陣列法從提取DNA到結果報告僅需7～8 h。Check-MDR CT102微陣列除了檢測KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM-1碳青霉烯酶基因，還可檢測TEM、SHV、CTX-M ESBLs，blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48基因，其特異性和敏感性都為100.0%,而blaKPC基因分別為100.0%和85.0%。blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48基因,陽性和陰性預測值都是100.0%，blaKPC基因的陽性和陰性預測值分別為100.0%和98.0%。核酸微陣列可區分同一分離株中產碳青霉烯酶基因及ESBLs、AmpC、膜孔蛋白缺失，但對于不動桿菌(OXA-23、OXA-24、OXA-58)可能會漏檢，無法檢測少見的PER、GES、VEB、BEL-1、ESBLs，無法區分各種酶亞型。

6.3 環介導等溫擴增技術 Notomi首先提出了環介導等溫擴增技術，其利用一種具有鏈置換反應DNA聚合酶和2對特殊引物，對靶序列上的6個特異序列進行特異擴增,在65 ℃的等溫條件下反應1 h即可將靶序列DNA擴增109～1010倍,產生肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀。環介導等溫擴增與PCR比較，檢測bla(NDM-1)和bla(KPC)具有更大的敏感性和特異性且快速，NDM-1陽性參考菌株基因組每管1 pgDNA檢出[19]。345份臨床樣本的檢測結果顯示,與PCR檢測結果100%的一致,其中3個受污染的標本被正確檢出,PCR卻不能，但其高敏感性可能造成假陽性導致應用受到一定的限制[20]。

7 結 語

產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。碳青霉烯酶的檢測方法主要有耐藥菌篩選、表型確認、基因水平分析等，效能各有利弊，而快捷、方便、準確的實驗室檢測方法有待進一步研究。臨床微生物實驗室應根據流行病學資料制定統一的適合該地區的實驗室檢測標準，將碳青霉烯酶檢測作為實驗室常規項目，可最大限度地發現耐藥菌株，為臨床提供快速、準確的信息，針對性地進行抗菌治療和控制產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的傳播，防止該類病原菌的擴散，有效控制醫院感染的發生。

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廣西醫藥衛生自籌經費計劃課題(Z2014152)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.060

A

1672-9455(2015)12-1798-03

2014-12-22

2015-02-15)