煙草花粉冷凍干燥方法研究初報

李宗平，張俊杰，彭　灝，陳茂勝，楊麗萍，徐世平，王文明，郭宇龍

（湖北省煙草科學研究院，中國煙草白肋煙試驗站，武漢 430030）

煙草花粉冷凍干燥方法研究初報

李宗平，張俊杰，彭灝，陳茂勝，楊麗萍，徐世平，王文明，郭宇龍

（湖北省煙草科學研究院，中國煙草白肋煙試驗站，武漢 430030）

摘要：采用多因素試驗方法對煙草花粉冷凍干燥中的預凍時間、抽真空干燥時間和預凍前添加防凍劑等3個因素進行了研究。結果表明，3個因素對花粉干燥均有顯著的影響，對花粉活力及授粉后的坐果率影響較小；抽真空干燥時間是影響花粉干燥的主要因素；預凍時間與抽真空干燥時間的互作效應較大。認為煙草花粉冷凍干燥處理，以預凍時間2～3 h，抽真空時間12 h左右為宜，一般不需添加防凍劑。

關鍵詞：煙草花粉；冷凍干燥；水分散失率；花粉活力；坐果率

隨著煙草產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，煙草雄性不育雜交種的推廣種植已逐步成為煙葉生產(chǎn)的主導方向［1-4］。近年來，隨著介質(zhì)花粉、煙草雜交授粉新方法等技術的研發(fā)及應用［5-6］，花粉貯藏已成為雜交制種過程的一個重要生產(chǎn)環(huán)節(jié)。在眾多影響貯藏花粉活力及壽命的因素中，貯藏的溫度和相對濕度是主要關鍵［7］。為此，提高貯藏花粉活力的研究大多集中在貯藏條件的改善等方面，如硅膠干燥貯藏、低溫貯藏、超低溫貯藏等［8-14］。

冷凍干燥技術其原理是先讓物料內(nèi)的水分完全凍結，再在一定的低溫真空條件下使凍晶升華，從而達到脫水的目的。其優(yōu)點是干燥徹底，能排查95%～99%的水分；物料的活性成分損失小，復水后其形態(tài)、生理機能迅速恢復；對貯藏條件要求不嚴，密封后在室溫下亦能長期貯藏。該技術現(xiàn)已廣泛用于保存生物制劑、醫(yī)藥產(chǎn)品、文物保護、食品加工等方面［15-16］。李興詩等［17］對白菜、泡桐的花粉研究結果認為，冷凍干燥后的花粉在室溫保存30～45 d仍有較高的活力。目前，利用冷凍干燥技術貯藏煙草花粉鮮見報道。

本研究旨在通過對冷凍干燥中的預凍時間、真空干燥時間及添加冷凍保護劑等方面的試驗，為煙草雜交制種過程中大批量的花粉貯藏提供方法及依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

白肋煙B37的花粉。

1.2試驗方法

2012年7月5—15日在中國煙草恩施良種繁育基地，采集白肋煙B37的花粉，放在有硅膠的干燥器中，密封后再放入低溫冰柜中備用。7月20、21、22日分組取樣先檢測處理前水分、再進行冷凍干燥處理，然后取樣檢測處理后水分和花粉活力，7月23日，取冷凍干燥處理前（對照）和處理后的花粉進行田間授粉試驗，授粉后7 d即7月30日調(diào)查田間坐果率。

1.2.1試驗設計采用3因素3水平即L9（34）正交試驗表設計。A因素：預凍時間；B因素：抽真空時間；C因素：添加防凍劑。3次重復，共27個處理，每處理4 g花粉。各因素水平設定及試驗處理設計詳見表1。

表1　試驗處理設計L9（34）正交表Table1　Orthogonal table with design of experimental treatment L9（34）

1.2.2冷凍預凍及干燥方法用北京博醫(yī)康生產(chǎn)的FD-1A-50冷凍干燥機進行冷凍干燥。花粉先在冷凍機的冷阱中預凍，溫度-50～-55℃，達到預定時間后取出，平攤在冷凍干燥機的物料盒中進行真空干燥。花粉厚度＜10 mm，溫度-45～-50℃，氣壓穩(wěn)定在8～10Pa。

1.2.3水分檢測及水分散失率計算MA150紅外水分測定儀檢測冷凍干燥處理前后的花粉水分含量，4次重復，每次0.5g花粉。計算水分散失率。公式：

花粉水分散失率/%=［（處理后水分－處理前水分）/處理前水分］×100%。

1.2.4花粉活力檢測采用離體萌發(fā)培養(yǎng)法檢測花粉活力。培養(yǎng)液為葡萄糖3 mg+硼酸50mg+氯化鈣20 mg+1000 mL水［18］。電熱恒溫箱溫度28 ℃、培養(yǎng)時間2 h。顯微鏡統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。用顯微標尺測量花粉管長度，花粉管長度大于花粉粒2倍為有效粒數(shù)，4次重復，取加權平均值。花粉萌發(fā)率/%=萌發(fā)有效數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%［10］。

1.2.5田間雜交授粉及坐果率統(tǒng)計冷凍干燥后的花粉在溫度25～28℃、相當濕度95%的生物培養(yǎng)箱內(nèi)復水0.5h后［17］，分別與MSB21進行雜交授粉，每處理5株，4次重復，7 d后統(tǒng)計授粉坐果率，取加權平均值。坐果率%=青果數(shù)/授粉花數(shù)× 100%。

2　結果

2.1不同處理對水分散失率的影響

花粉水分含量是影響花粉儲藏時間、花粉活力的關鍵因素之一。冷凍干燥的目的是利用冷凍干燥的原理盡多的排出花粉內(nèi)的水分、抑制酶的活性、延長花粉壽命。在本試驗中A、B、C三個因素和因素間的水分散失率效應互作效應均達極顯著水平。B因素是影響水分的主要因素，其次是A因素，C因素影響最小。在A因素中，有隨預凍時間的增長花粉水分散失率增大的趨勢，A3（4 h）顯著高于A1（2 h）；B因素中，隨抽真空時間的增長花粉水分散失率大幅增加的趨勢，B3（12 h）＞B2（8 h）＞B1（4 h），差異均達極顯著水平；C添加防凍劑各水平間差異不顯著（表2）。

表2　水分散失率 %Table2　The water lossrate %

表3　水分散失率互作效應 %Table3　Interaction effect of water lossrate %

進一步分析因素互作效應，在A因素的不同水平下，B因素和C因素的水分散失率差異較小，有隨預凍時間的延長，水分散失率增大的趨勢；A因素同一水平下，B因素和C因素的各水平間的差異較大，差異均達極顯著水平。由此認為，在同等A因素下，B因素是水分散失的主要因素，其影響大于C因素。詳見表3。

在B因素的不同水平下，A因素和C因素水分散失率為34.26%～98.10%和38.20%～97.90%，進一步說明B因素是水分散失的主要因素；B因素同一水平下，A因素和C因素的水分散失率差異相對較小。

在C因素不同水平中，B因素水平間的水分散失率差異大于A因素。其中，B因素不同水平的水分散失率差異較大均達顯著或極顯著水平。

2.2不同處理對花粉活力的影響

花粉活力的方差分析結果，因素間的差異未達顯著水平，但A因素與B因素間、C因素間的互作效應達顯著水平。各因素不同水平間花粉活力差異顯著性分析結果如表4所示。B因素中B3（12 h）的花粉活力顯著高于B1（4 h）；A因素和C因素的3個水平間花粉活力差異未達顯著水平。說明抽真空時間對花粉活力有一定的影響。

表4　花粉活力 %Table4　The pollen vitality

表5　花粉活力互作效應 %Table5　Pollen viabilityinteraction %

各處理間的花粉活力互作效應分析結果表明，在A因素的不同水平下，B因素水平間花粉活力差異大于C因素。其中，A1（2 h）中B和C因素的花粉活力呈下降趨勢，在A2（3 h）、A3（4 h）中則呈上升趨勢。在B因素不同水平下，A因素水平間花粉活力差異大于C因素，其中在B1、B2中A因素的花粉活力呈下降趨勢，在B3中呈上升趨勢；C因素的水平間的花粉活力差異未達顯著水平。在C因素不同水平下A因素和B因素水平間的花粉活力差異不大。各因素及水平間差異顯著性分析結果詳見表5。

2.3不同處理的田間坐果率比較

不同因素的坐果率方差分析表明，各因素對花粉授粉的田間坐果率影響不大，差異未達顯著水平。據(jù)表6所示，A、B、C因素的3個水平間的差異均未達顯著水平。

表6　坐果率 %Table6　Setting rate %

3　討論

一般預凍時間的長短與物料共晶點、預凍溫度及凍結速率等有關［15-16，19］。有報道認為大多農(nóng)作物組織的共晶點在-20～-40℃，預凍溫度比共晶點低5～20℃，預凍時間一般為2～4 h［15，19-21］。本試驗結果與之基本一致。煙草花粉的共晶點、預凍溫度、冷凍速率及花粉密度等參數(shù)及單位面積花粉的堆積厚度與預凍時間的關系等均有待進一步研究。

真空干燥是利用低溫低壓下傳質(zhì)傳熱原理，使冰直接升華為水蒸氣，再用真空系統(tǒng)中的水汽凝結器將水蒸氣冷凝，從而獲得干燥制品。抽真空時間及干燥效果與升華溫度、升華速率、加熱方式、真空度、及物料厚度有關。本研究中花粉平攤厚度1 cm以內(nèi)，升華溫度-45～-50℃，氣壓穩(wěn)定在8～10Pa，滿足了花粉水分升華的條件，抽真空時間12 h左右能排除花粉97%～98%的水分，與前人研究的水分升華速度在1 mm/h左右的結論一致［15-16］。

預凍前添加防凍劑能防止冷凍干燥過程中因低溫效應、冷凍效應和脫水效應影響物體的活性成分變性［16］。對于諸如眼角膜等活性生物體的保存或生物標本冷凍干燥中，選取保護劑是凍干過程的關鍵技術［22］。目前對于冰凍保護劑的作用機理尚未了解透徹。且保護劑的種類很多，不同生物制品需用的不同的保護劑。目前常用的冷凍保護劑有二甲基亞砜（DMSO）、甘油、糖和糖醇等，有報道認為在紫菜薹花粉超低溫保存中以DMSO和蔗糖為主， 其中蔗糖濃度對花粉保存效果有明顯的影響［23］。在本研究中，冷凍干燥前添加防凍劑對花粉干燥及花粉活力無明顯的影響，添加防凍劑的花粉復水后，易結團，不利田間人工授粉操作。

本研究中僅對冷凍干燥后的花粉進行了活力檢測和田間授粉后的坐果率統(tǒng)計，對其成分、形態(tài)、結構和各酶的活性等方面的變化尚需進一步研究。

4　結論

利用冷凍干燥技術進行煙草花粉干燥是可行的。在保證花粉較高活力的前提下，能排查花粉內(nèi)97%～98%的水分，有利于花粉長期儲藏。在冷凍干燥過程中，以預凍溫度-50～-55℃，預凍時間2～4 h，抽真空時間12 h左右為宜。

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中圖分類號：S572.03

文章編號：1007-5119（2015）02-0038-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.007

基金項目：湖北省煙草專賣局項目“經(jīng)濟、高效煙草種子生產(chǎn)技術研究”（027Y2011-051）

作者簡介：李宗平，男，高級農(nóng)藝師，長期從事煙草良種繁育工作與研究。E-mail：li63@163.com

收稿日期：2013-09-30修回日期：2015-04-01

Preliminary Report on the Freeze-drying Method for Tobacco Pollen

LI Zongping， ZHANG Junjie， PENG Hao，CHEN Maosheng， YANG Liping， XU Shiping，WANG Wenming， GUO Yulong
（Tobacco Research Academy of Hubei Province， Burley Tobacco Experimental Station of CNTC， Wuhan430030， China）

Abstract:Multi-factor test method for freeze-drying of tobacco pollen， pollen pre-freezing time， vacuum drying time and add antifreeze before pre-freezing three factors were studied. The results showed the three factors significantly affected pollen drying，pollen viability and pollination on fruit setting rate.Vacuum drying time was the main factors affecting pollen.Pre-freezing time and vacuum drying time had great interaction. Tobacco pollen freeze-drying without adding antifreeze， pre freezing time was 2～3h，vacuum time was12h.

Keywords:tobacco pollen； freeze-drying；water loss rate； pollen viability；fruit setting rate