低氧誘導神經干細胞凋亡和miR-26a低表達*

李 芳， 魏紅艷， 鄧宇斌， 李 欣， 李恒杰， 胡春林， 盧遠征， 廖曉星△

(中山大學附屬第一醫院 1急診科， 2轉化醫學中心，廣東 廣州 510080)

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低氧誘導神經干細胞凋亡和miR-26a低表達*

李 芳1， 魏紅艷1， 鄧宇斌2， 李 欣1， 李恒杰1， 胡春林1， 盧遠征1， 廖曉星1△

(中山大學附屬第一醫院1急診科，2轉化醫學中心，廣東 廣州 510080)

目的： 初步探討氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)是否誘導神經干細胞(neural stem cells，NSCs)凋亡及其機制，探討NSCs凋亡是否引起microRNA-26a(miR-26a)表達變化。方法: 用不同劑量的CoCl2處理NSCs，CCK-8檢測細胞活力；TUNEL檢測細胞凋亡；建立CoCl2誘導NSCs凋亡的模型，將NSCs分為對照組和凋亡組，real-time PCR檢測miR-26a-3p、miR-26a-5p、GSK-3β、Bcl-2、Bax和caspase-3的表達；Western blotting檢測Bcl-2和Bax的蛋白水平。結果: CCK-8結果顯示不同濃度(200、400和600 μmol/L)CoCl2作用24 h，NSCs活力呈劑量依賴性下降(P<0.05)。TUNEL檢測顯示CoCl2(200、400和600 μmol/L)作用24 h后NSCs凋亡率呈劑量依賴性增加(P<0.05)。Real-time PCR和Western blotting結果表明凋亡組miR-26a、GSK-3β、Bax和caspase-3表達增加，Bcl-2、Bcl-2/Bax蛋白水平下降(P<0.05)。結論: CoCl2(400 μmol/L)作用24 h可建立NSCs凋亡模型，其機制可能與線粒體凋亡通路有關；NSCs凋亡時miR-26a表達減少。

氯化鈷； 細胞凋亡； 神經干細胞； miR-26a

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新和多能分化潛能，是治療多種神經系統疾病的希望。但在缺血缺氧性腦病中大腦常嚴重低氧而使NSCs凋亡增加，自我更新和分化為神經元的能力受限[1]。抑制嚴重低氧微環境中NSCs凋亡是使NSCs真正發揮作用的關鍵。然而其機制尚不完全清楚。

MicroRNA-26a(miR-26a)在多種腫瘤中出現表達變化，是調控膽管細胞癌等細胞凋亡和增殖的重要靶點[2]。在大鼠缺氧模型中miR-26a則可調控新生心肌細胞凋亡[3]。miR-26a是否與低氧誘導的NSCs凋亡有關目前卻未見報道。氯化鈷(cobalt chloride, CoCl2)是公認的缺氧誘導劑，具有使用方便、效果確切等優點，已用于誘導心肌細胞等凋亡[4]。本研究擬初步探討CoCl2誘導NSCs凋亡及機制，探討NSCs的凋亡是否與miR-26a有關。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級雌性SD大鼠(孕13.5 d)，由中山大學中山醫學院動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0029。

2 主要試劑

DMEM/F12(1∶1)培養基、B27、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、acctuse酶和青、鏈霉素雙抗購自Gibco；免疫細胞化學染色用小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體和GAPDH、Bcl-2、Bax兔抗大鼠Western blotting抗體購自Cell Signaling；細胞核復染試劑Hoechst 33342和TUNEL凋亡試劑盒購自Roche；CoCl2購自Sigma；CCK8試劑盒購自Dojindo；mRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司設計和合成，見表1。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1 NSCs的提取、培養和鑒定 取孕13.5 d的SD大鼠胚胎，在冰PBS中機械分離海馬組織，離心法收集細胞，并將其重懸于DMEM/F12 (1∶1)培養基中，添加試劑有以下幾種：20 mg/L EGF、20 mg/L bFGF、1% B27、2 mmol/L谷氨酰胺、5×103U/L青霉素和5 mg/L鏈霉素。細胞以2×108/L密度種植在25 cm2培養瓶中，每2～3 d半量換液，根據細胞的生長情況5～7 d傳代1 次，傳至第3 代細胞用于實驗。第3代NSCs培養7 d后在同樣的培養基中種植在多聚賴氨酸包被的玻片上，約4 h細胞貼壁后，吸出培養基，用4%的多聚甲醛固定，用0.3%的Triton X- 100通透細胞，并用10%的BSA封閉，用小鼠抗大鼠nestin抗體4 ℃作用16 h，用于標記NSCs的中間絲蛋白，再用熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 594室溫下作用2 h，用Hoechst 33342染核后，封片固定，用熒光顯微鏡檢測。

3.2 實驗分組 用0、200、400和600 μmol/L幾種不同濃度的CoCl2干預24 h誘導NSCs凋亡，探討最佳致凋亡濃度，建立NSCs凋亡模型。分為正常對照組(control)和CoCl2組。

3.3 細胞存活率測定 取對數生長期細胞，以每孔1×104接種于96孔板，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，采用0、200、400和600 μmol/L不同濃度的CoCl2處理NSCs 24 h后與CCK-8孵育4 h，用酶聯免疫檢測儀測定450 nm處吸光度(A)，按公式存活率(%)=實驗組A/對照組A×100%，算出NSCs存活率。同時也采用上述方法檢測了400 μmol/L CoCl2作用不同時間的NSCs存活率。

3.4 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測NSCs凋亡 NSCs種于多聚賴氨酸包被的載玻片上，加上述不同濃度的CoCl2處理24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.1% Triton X -100透膜，0.1%檸檬酸鈉孵育后，用TUNEL混合液染色，再用Hoechst 33342染核，封片固定，熒光顯微鏡檢測凋亡。凋亡指數=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。

3.5 Real-time PCR測定miR-26a、GSK-3β、Bax、Bcl-2和caspase-3的表達 用TaKaRa RNAiso Plus提取RNA。所提RNA 用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測A260/A280在1.8～2.0 之間，并檢測濃度，-80 ℃保存備用。檢測miR-26a時采用Poly(A)法進行反轉錄，U6為內參照。用TaKaRa PrimeScript miRNA QPCR Starter Kit Ver. 2.0進行反轉錄和PCR。于LightCycler 480實時PCR 系統中進行real-time PCR。反應條件為：預變性95 ℃ 30 s；PCR反應：95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40 cycles；熔解曲線分析：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s。GSK-3β、Bax、Bcl-2和caspase-3反轉錄用TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)完成。取100 ng mRNA莖環引物，用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(Tli RNase H Plus)試劑盒于LightCycler 480實時PCR系統中進行real-time PCR。反應條件：預變性95℃ 30 s；PCR反應取定量分析模式，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 cycles； 熔解曲線分析：95 ℃ 5 s；50 ℃ 30 s。β-actin為內參照。用2-ΔΔCt法計算以上各基因相對表達量。

3.6 Western blotting檢測 用裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質含量。每個樣本取等量蛋白進行SDS-PAGE分離蛋白，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉非特異性抗原結合位點后，加入Bcl-2、Bax、GAPDH的I抗以及相應HRP標記的II抗，ECL進行顯色。GAPDH為內參照。

4 統計學處理

數據用SPSS 13.0軟件分析。計量資料表示方法為均數±標準差(mean±SD)，兩組間比較采用Student’s t test，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 胚胎海馬來源NSCs的培養和鑒定

胚胎海馬來源的NSCs在DMEM/F12完全培養基中可迅速增殖，培養3～5 d后可形成神經球。免疫熒光染色示我們提取的細胞可表達nestin(NSCs上的中間絲蛋白)，見圖1。這表明我們提取的細胞具有NSCs特性。

Figure 1.Identification of the cultured NSCs by observing the immunofluorescence of nestin (×400).

2 CoCl2對NSCs存活率的影響

CCK-8結果顯示隨CoCl2濃度的增加，NSCs存活率逐漸下降(P<0.05)。200、400和600 μmol/L CoCl2作用24 h，NSCs的存活率分別是77.6%±6.8%、54.2%±8.3%和19.4%±6.1%。400 μmol/L CoCl2作用于NSCs，隨作用時間延長，NSCs的存活率降低(P<0.05)。400 μmol/L CoCl2作用12 h、24 h和48 h，NSCs的存活率分別是61.4%±6.9%、51.7%±8.1%、15.7%±4.2%。表明CoCl2對NSCs存活率的影響呈時間和劑量依賴性，見圖2。

3 CoCl2致NSCs凋亡

為了檢測不同劑量的CoCl2對NSCs凋亡的作用，我們采用了TUNEL法檢測了各組NSCs的凋亡率。TUNEL染色顯示凋亡的NSCs細胞核呈紅色。不同濃度的CoCl2作用24 h后NSCs凋亡率較control組增加(P<0.05)。隨CoCl2劑量增加，NSCs凋亡率增加。其中400 μmol/L CoCl2誘導NSCs凋亡較control組增加最明顯，見圖3。結合CCK-8的結果，我們選取400 μmol/L CoCl2作用24 h制備NSCs凋亡模型進行后續實驗。

Figure 3.Apoptosis of the NSCs detected by TUNEL assay(×200). Mean±SD. n= 5. *P<0.05 vs control group.

4 miR-26a在NSCs凋亡模型中低表達

為了檢測NSCs凋亡是否與miR-26a有關，我們采用real-time PCR檢測CoCl2組和control組miR-26a-3p和miR-26a-5p的表達。結果顯示，CoCl2組miR-26a-3p和miR-26a-5p的表達較control組明顯下調(P<0.05)，見圖4，提示NSCs凋亡增加時miR-26a表達下調，miR-26a可能是調控NSCs凋亡的重要因子。

Figure 4.miR-26a -5p and miR-26a -3p expression in the NSCs treated with 400 μmol/L CoCl2. U6 was used as an internal control. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control group.

5 NSCs凋亡模型中GSK-3β及凋亡相關蛋白的表達變化

為了檢測NSCs凋亡是否與GSK-3β及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表達變化有關，我們采用real-time PCR檢測CoCl2對GSK-3β、Bcl-2、Bax和caspase-3表達的影響。結果顯示CoCl2上調GSK-3β、Bax和caspase-3的表達，而下調Bcl-2的表達(P<0.05)。同時我們采用Western blotting 檢測了Bax和Bcl-2表達，結果顯示Bcl-2和Bcl-2/Bax較control組表達下調(P<0.05)，而Bax則表達上調(P<0.05)，見圖5。

討 論

CoCl2可誘導多種細胞損傷，本研究CCK-8結果顯示CoCl2對NSCs的損傷呈劑量依賴性，CoCl2對NSCs的半抑制濃度是400 μmol/L。但CoCl2對不同細胞的致損傷濃度不同。100 μmol/L CoCl2作用7 d可使少突膠質細胞前體細胞發生慢性缺血缺氧性損傷[5]。200 μmol/L CoCl2處理可建立肝癌細胞缺氧損傷模型[6]。本研究發現400 μmol/L氯化鈷作用24 h可建立NSCs凋亡模型。其它研究中CoCl2也是致細胞凋亡的常用試劑。600 μmol/L CoCl2可使PC12細胞凋亡顯著增加[7]。以上結果表明，CoCl2可誘導NSCs損傷，可用于建立NSCs低氧損傷和凋亡模型。

Figure 5.The expression of GSK-3β, Bax, BCl-2 and caspase-3. A, B: real-time PCR analysis showed up-regulation of GSK-3β, Bax and caspase-3 and down-regulation of BCl-2. β-actin was used as an internal control. C: Western blotting analysis of Bax and BCl-2 protein expression. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control group.

本研究通過real-time PCR和Western blotting實驗發現CoCl2誘導的NSCs凋亡模型中Bax、caspase-3表達上調，而Bcl-2、Bcl-2/Bax則下調。線粒體凋亡途徑在缺血缺氧性腦損傷中起了重要作用[8]。Bax和Bcl-2是線粒體凋亡途徑的重要因子，Bcl-2/Bax下降在神經元的凋亡中起關鍵作用[9]。有文獻報道端粒酶反轉錄酶可通過增加Bcl-2/Bax比率而抑制神經元的凋亡[10]，提示CoCl2誘導NSCs凋亡可能涉及線粒體凋亡通路。

本研究中發現NSCs凋亡模型中miR-26a表達明顯下調。miR-26a與多種細胞的存活和凋亡有關。多項研究表明miR-26a促進細胞的增殖，減少細胞凋亡。研究發現miR-26a增加神經膠質細胞瘤的增殖和血管生成[11]。也有研究顯示miR-26a抑制小鼠骨骼肌細胞凋亡，促進其分化和增殖[12]。以上結果表明，miR-26a可能成為NSCs凋亡的重要調控因子。

本研究中real-time PCR的結果還表明NSCs凋亡模型中miR-26a減少的同時伴有GSK-3β升高。GSK-3β是一種多功能的激酶，參與了多種細胞凋亡和增殖的調控。文獻報道在膽管細胞癌中miR-26a通過抑制GSK-3β的表達而發揮促進腫瘤細胞的增殖和抑制凋亡的作用[2]。在胃癌細胞中GSK-3β過表達也可抑制其增殖[13]。以上結果提示miR-26a可能通過GSK-3β介導的信號通路發揮其在NSCs凋亡中作用，這也是本課題組下一步的研究方向。

綜上所述，CoCl2可誘導NSCs凋亡，其機制可能與線粒體凋亡通路有關。miR-26a、GSK-3β可能參與了低氧條件下NSCs凋亡的調控。

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Hypoxia promotes apoptosis of neural stem cells and down-regulates miR-26a

LI Fang1, WEI Hong-yan1, DENG Yu-bin2, LI Xin1, LI Heng-jie1, HU Chun-lin1, LU Yuan-zheng1, LIAO Xiao-xing1

(1EmergencyDepartment,2ResearchCenterofTranslationalMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaowens@163.com)

AIM: To investigate the effect of cobalt chloride (CoCl2) on the apoptosis of neural stem cells (NSCs) and the expression of microRNA-26a (miR-26a)invitro, and to explore the mechanisms of NSC apoptosis induced by CoCl2. METHODS: NSCs were exposed to CoCl2at different doses (200～600 μmol/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were measured by CCK-8 assay and TUNEL method. The expression of miR-26a-3p, miR-26a-5p, GSK-3β, caspase-3, Bcl-2 and Bax was examined by real-time PCR. The protein levels of Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting. RESULTS: The cell viability was inhibited and the apoptosis of NSCs was increased significantly by CoCl2in a dose-dependent manner (P<0.05). CoCl2at concentration of 400 μmol/L for 24 h was used to induce apoptosis and the expression of miR-26a was down-regulated compared with control (P<0.05). Exposure to CoCl2at concentration of 400 μmol/L up-regulated the expression of GSK-3β, caspase-3 and Bax, down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-2/Bax (P<0.05). CONCLUSION: CoCl2at concentration of 400 μmol/L induces the apoptosis of NSCs obviously. CoCl2may induce the NSC apoptosis by mitochondrial apoptotic pathway. Declining miR-26a may be related to NSC apoptosis.

Cobalt chloride; Apoptosis; Neural stem cells; miR-26a

1000- 4718(2015)01- 0081- 06

2014- 10- 08

2014- 11- 26

國家自然科學基金資助項目(No. 81372023)

△通訊作者 Tel: 020-87331698; E-mail: liaowens@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.016