黃芪多糖對慢性心衰大鼠心肌AMPK活性和FFA代謝的影響*

宋 杰， 胡陽黔， 劉 堅， 李 靜△

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院， 2湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

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黃芪多糖對慢性心衰大鼠心肌AMPK活性和FFA代謝的影響*

宋 杰1， 胡陽黔1， 劉 堅2， 李 靜2△

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，2湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

目的： 探討黃芪多糖(APS)對慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性和游離脂肪酸(FFA)代謝的影響。方法: 32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組、假手術(shù)組、模型組和APS組，每組8只。采用大鼠左側(cè)冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立心肌梗死后心衰模型。造模成功后，APS組大鼠給予APS(3 g·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃6周。采用心臟超聲檢測左心室舒張期內(nèi)徑(LVD)、左心室收縮期內(nèi)徑(LVS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS)；HE染色觀察心肌病理形態(tài)學(xué)改變；乙酰輔酶A合成酶-乙酰輔酶A氧化酶法(ACS-ACOD)檢測血清及心肌FFA濃度；Western blotting法測大鼠心肌總AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT/CD36)和肉毒堿軟脂酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果: 假手術(shù)組與對照組比較各項指標(biāo)無顯著差異。模型組較對照組LVEF和FS顯著降低(P<0.05)而LVD和LVS顯著增加(P<0.05)。APS組LVEF和FS較模型組明顯改善(P<0.05)并且LVD和LVS較模型組明顯減小(P<0.05)。HE染色顯示模型組較對照組心肌壞死灶增加，殘余心肌細(xì)胞減少；而APS組較模型組心肌壞死灶減少，殘余心肌細(xì)胞增多。模型組血清及心肌FFA濃度較對照組明顯增加(P<0.05)；APS組血清及心肌FFA濃度較模型組明顯減少(P<0.05)。模型組p-AMPK、CPT-1和細(xì)胞膜FAT/CD36表達(dá)較對照組顯著減少(P<0.05)；而與模型組相比APS組p-AMPK、CPT-1和細(xì)胞膜FAT/CD36表達(dá)明顯增加(P<0.05)。結(jié)論: APS可能通過激活慢性心衰大鼠AMPK相關(guān)通路促進(jìn)心肌攝取利用FFA，從而改善慢性心衰。

黃芪多糖； 游離脂肪酸； 腺苷酸活化蛋白激酶； 慢性心力衰竭

慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各種器質(zhì)性或功能性心臟病導(dǎo)致心室射血能力受損的綜合征，其病死率約50%。目前越來越多的臨床及實驗研究均表明，CHF都存在心肌能量代謝障礙和能量代謝重塑。在正常成人，心肌需要的高達(dá)60%～90%的能量由游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)供給。CHF后期心肌FFA代謝障礙，能量大部分由葡萄糖酵解供給，糖酵解提供的能量很難滿足心肌的需求，并由此伴隨著心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心功能逐漸惡化。目前針對CHF能量代謝障礙的有確切療效的藥物很少，研究這方面藥物有很好的市場前景及實用價值。我們先前研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖(Astra-galuspolysaccharides, APS)具有降低FFA脂毒性、改善骨骼肌FFA代謝[1-2]以及改善胰島素抵抗[3]的作用。另有研究表明APS具有改善CHF的功效[4-5]，但目前機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探索APS對CHF大鼠FFA代謝的影響及機(jī)制，為探討治療CHF的新藥及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

雄性SD大鼠由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供；優(yōu)化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS(80～120 kD)(湖北中醫(yī)學(xué)院藥用植物鑒定教研室鑒定)[6]；游離脂肪酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)抗體、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)抗體、肉毒堿軟脂酰轉(zhuǎn)移酶-1(carnitine palmitoyltransferase I，CPT-1)抗體和脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36)抗體均購自Upstate。BCA Protein Assay Kit購自Pierce；蛋白內(nèi)參照采用GAPDH，購自Abcam；Protein Detector Western Blot Kit Lumiglo System購自KPL。Vevo 770高分辨率小動物超聲系統(tǒng)購自Vi-sual Sonics。

2 方法

2.1 心力衰竭動物模型建立與分組 采用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)方法[7]：麻醉固定備皮后行氣管插管連接小動物呼吸機(jī)，正壓人工呼吸(潮氣量7～8 mL，呼吸頻率80 min-1，描記大鼠正常心電圖。消毒鋪巾后，沿胸骨左側(cè)第3、4肋間隙開胸，用眼科小鑷子輕提并剪開心包膜，暴露心臟用無菌齒鑷輕提左心耳，暴露主動脈根部，線繞過冠狀動脈(心上緣)結(jié)扎心肌組織2～3 mm，打2個死結(jié)，以縫線以下心肌色澤變淺蒼白，同時心電監(jiān)護(hù)示肢體導(dǎo)聯(lián)R波振幅及ST段明顯抬高為結(jié)扎成功。縫合胸壁，皮下注射青霉素8×105U、速尿0.2 mL和利多卡因0.2 mL，待恢復(fù)自主呼吸后撤離呼吸機(jī)。術(shù)后4 h常規(guī)飼養(yǎng)食水。第2周飼料減半。第3周每日增加游泳20 min。第28天麻醉后備皮，大鼠取仰臥位，應(yīng)用Vevo 770高分辨率小動物超聲系統(tǒng)檢測，超聲測量依據(jù)美國超聲心動學(xué)會制定的大鼠達(dá)到心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)：射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)≤45% ，證明結(jié)扎左冠狀動脈前降支可成功復(fù)制心肌梗死后心力衰竭大鼠模型。32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照(control)組、假手術(shù) (sham) 組、模型 (model) 組和APS 組，每組8只。造模成功后，APS組大鼠給予APS(3 g·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃6周。

2.2 心臟超聲檢測 各組大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后備皮，應(yīng)用Vevo 770高分辨率小動物超聲系統(tǒng)測定左心室舒張期內(nèi)徑(left ventricular diastolic diameter，LVD)、收縮期內(nèi)徑(left ventricular systolic diameter，LVS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。

2.3 血清及心肌FFA含量測定 大鼠處死后開胸取大鼠左心室心尖部心肌，用PBS沖洗3次，剪成小塊，然后水浴下超聲破碎細(xì)胞20次，每次5～10 s，再1 000 r/min 離心10 min，取上清液至EP管備用。按試劑盒說明書步驟采用乙酰輔酶A合成酶-乙酰輔酶A氧化酶(acetyl coenzyme A synthetase and acetyl coenzyme A oxidase， ACS-ACOD)法測定。用自動加樣器分別移取待測血清及上清液10 μL；加入400 μL發(fā)色試劑A；5 min后，加入200 μL發(fā)色劑B；10 min后，測定吸光度(A)，主波長546 nm，副波長660 nm。FFA濃度測定由全自動生化儀完成。

2.4 心肌病理形態(tài)學(xué)觀察 大鼠處死后開胸取大鼠左心室心尖部心肌，以4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，用4% 甲醛固定48 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋，病理切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.5 Western blotting檢測 大鼠處死后開胸取大鼠左心室心尖部心肌，進(jìn)行裂解，置4 ℃采用超速離心法分離提取總蛋白及胞膜蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min，SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉、漂洗后加入Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔Ⅱ抗(1∶800稀釋，KPL)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細(xì)胞測量程序的圖形分析軟件系統(tǒng)測出相對光密度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，組間差異用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心臟超聲檢測

假手術(shù)組與對照組比較各項指標(biāo)無顯著差異。與正常對照組比較，模型組LVEF和FS顯著降低(P<0.05)，LVD和LVS顯著增加(P<0.05)。APS組LVEF和FS較模型組明顯改善(P<0.05)，與對照組比較差異顯著(P<0.05)；ASP組LVD和LVS較模型組明顯減小(P<0.05)，但與對照組比較無顯著差異,見表1。

表1 各組LVS、LVD、LVEF和FS比較

△P<0.05vscontrol group；▲P<0.05vsmodel group.

2 血清及心肌FFA含量測定

與對照組比較，模型組血清及心肌FFA濃度明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，APS組血清及心肌FFA濃度明顯減少(P<0.05)；假手術(shù)組與對照組比較無明顯差異，見表2。

表2 APS對CHD大鼠血清及心肌FFA濃度的影響

△P<0.05vssham group；▲P<0.05vsmodel group.

3 心肌病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色光鏡下顯示：正常組及假手術(shù)組心肌細(xì)胞核橫紋清晰，未見變性壞死灶；模型組可見室壁局部不規(guī)則點片狀壞死，心肌纖維數(shù)量明顯減少，殘余心肌染色變淡，橫紋不清晰，部分壞死灶被膠原纖維疤痕組織替代，間質(zhì)內(nèi)炎性滲出明顯，心肌纖維間有大量結(jié)締組織增生；APS組壞死灶內(nèi)心肌纖維數(shù)量明顯減少，殘余心肌細(xì)胞較模型組增加，橫紋清晰，部分壞死灶被膠原纖維的疤痕組織取代，炎性滲出減少，見圖1。

Figure 1.Myocardial morphological changes(HE staining，×40).A: control group；B: sham group；C: model group； D: APS group.

4 相關(guān)蛋白表達(dá)情況

由圖2可見，對照組與假手術(shù)組各種相關(guān)蛋白表達(dá)比較無明顯變化；模型組p-AMPK、CPT-1和細(xì)胞膜FAT/CD36表達(dá)顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，APS組p-AMPK、CPT-1和細(xì)胞膜FAT/CD36表達(dá)明顯增加(P<0.05)。各組總AMPK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Figure 2.The expression of AMPK, p-AMPK, FAT/CD36 and CPT-1 proteins. Mean±SD. n=8. ▲P<0.05 vs control or sham group; △P<0.05 vs model group.

討 論

大量研究表明， CHF時心肌能量代謝出現(xiàn)“胚胎化”，所謂胚胎化是指胚胎發(fā)育階段心肌細(xì)胞能量供應(yīng)主要來源于糖酵解和乳酸氧化，出生后，脂肪酸的氧化率急劇增加，很快成為心肌的主要能量來源，約占總能量來源的60%～90%，而心衰時出現(xiàn)的這種代謝底物攝取和選擇向胚胎發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變：即以利用葡萄糖供能逐漸增加，利用FFA供能逐漸減少的這種變化稱為“胚胎化”。有人認(rèn)為FFA選擇的改變正是導(dǎo)致心功能受損的原因[8]。對于CHF疾病進(jìn)展過程中FFA和葡萄糖作為能量代謝底物的動態(tài)演變過程尚有一些爭議，綜合相關(guān)研究，目前統(tǒng)一的觀點是[9-11]：在心衰早期脂肪酸的利用不變或輕微增加，在心衰末期會顯著降低；在葡萄糖利用方面，在心衰早期利用就明顯增加，在末期由于胰島素抵抗的存在可能會導(dǎo)致心肌對葡萄糖的利用減少。代謝底物葡萄糖氧化增加，可提高能源的使用效率，這在心衰早期是一種有利的代償，而心衰后期FFA利用紊亂在心衰進(jìn)展中則起到不利的效應(yīng)。如果我們選擇最佳的心臟代謝底物，將有利于改善心功能及減慢心衰的進(jìn)展[12]。

CHF后期存在高FFA。大量流行病學(xué)資料證實FFA是引起胰島素抵抗的最主要非激素物質(zhì)之一。在眾多心血管疾病的危險因素中胰島素抵抗處于核心地位, 或者說胰島素抵抗是滋生多種代謝相關(guān)疾病的共同土壤。我們先前研究發(fā)現(xiàn)： APS對于2型糖尿病動物模型具有增加胰島素敏感性、改善糖耐量、降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用[13-14]。近期我們研究發(fā)現(xiàn)APS可以增加骨骼肌細(xì)胞對FFA的攝取利用[1-2]。有研究表明APS具有改善CHF的功效[4-5]，但目前機(jī)制尚未研究清楚。

AMPK是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為“能量代謝總開關(guān)”，與糖脂代謝密切相關(guān)。我們近期在細(xì)胞水平的一項研究中發(fā)現(xiàn)[1-2]：在高FFA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞，AMPK活性被抑制；而APS可以通過活化被抑制的AMPK活性從而增加FFA的攝取利用，降低培養(yǎng)液中FFA濃度。我們注意到在CHF晚期同樣存在FFA利用障礙和高FFA水平；而APS被證實可改善CHF，那么APS是否可以通過改善CHF心肌細(xì)胞對FFA的攝取和利用改善心衰呢？本研究通過復(fù)制CHF模型，給予APS干預(yù)，發(fā)現(xiàn)APS可改善心臟功能，與前人研究一致。同時我們發(fā)現(xiàn)，CHF時FFA攝取利用障礙，存在血循環(huán)高FFA水平和心肌細(xì)胞內(nèi)FFA蓄積；APS可改善心肌細(xì)胞對FFA的利用，同時降低血循環(huán)FFA水平。本研究還發(fā)現(xiàn)CHF時AMPK活性被抑制，APS干預(yù)可活化被抑制的AMPK。

AMPK活性變化與心肌FFA攝取和利用有什么關(guān)系呢？我們觀察到與FFA轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的2個關(guān)鍵酶： FAT/CD36T和CPT-1。FAT/CD36主要表達(dá)于骨骼肌和心肌，CD36是心臟FAT的主要形式。FAT/CD36主要存在于胞漿中，它向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位可促進(jìn)FFA攝取；CPT-1存在于線粒體膜上，CPT-1表達(dá)增加可促進(jìn)FFA進(jìn)入線粒體氧化。本研究發(fā)現(xiàn)，CHF時FAT/CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位減少，同時CPT-1表達(dá)減少，這可能導(dǎo)致了FFA攝取利用障礙。

已經(jīng)有較多研究證實AMPK可調(diào)節(jié)CPT-1表達(dá)，對于AMPK與FAT/CD36轉(zhuǎn)位之間的關(guān)系目前尚未完全清楚。我們先前研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞，模擬高FFA環(huán)境，APS干預(yù)可促進(jìn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位；加用AMPK抑制劑compound C后，APS促進(jìn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位的作用被抑制[1-2]。在CHF動物模型上，APS促進(jìn)FAT/CD36轉(zhuǎn)位也很可能是通過活化AMPK而完成，需要我們后續(xù)研究進(jìn)一步證實。

綜上所述，APS可以改善CHF，可能機(jī)制是CHF時AMPK活性被抑制，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶FAT/CD36細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位減少和CPT-1表達(dá)減少，從而導(dǎo)致FFA攝取利用障礙；而APS可活化被抑制的AMPK，增加FAT/CD36轉(zhuǎn)位同時增加CPT-1表達(dá)，從而促進(jìn)心肌對FFA攝取利用，改善心肌代謝底物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善心衰。本研究進(jìn)一步明確了CHF時FFA攝取利用障礙的機(jī)制以及APS的改善作用；為APS成為治療CHF藥物提供了理論和實驗基礎(chǔ)。

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Astragaluspolysaccharides improve chronic heart failure by promoting myocardial FFA metabolism via AMPK pathway

SONG Jie1, HU Yang-qian1, LIU Jian2, LI Jing2

(1DongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine，2HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China.E-mail:doctorsongjie@163.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragaluspolysaccharides (APS) on chronic heart failure and its mechanism. METHODS: Male SD rats (n=32) were randomly divided into control group, sham group, model group and APS group (8 rats in each group). The left coronary artery ligation in the rats was conducted to establish myocardial infarction heart failure model. After modeling, the rats in APS group were given APS (3 g·kg-1·d-1) by intragastric administration for 6 weeks. Left ventricular diastolic diameter (LVD), left ventricular systolic diameter (LVS), left ventricular ejection fraction (LVEF) and fractional shortening (FS) were detected by echocardiography. HE staining was used to observe the pathological changes. The concentrations of free fatty acid (FFA) in the serum and myocardium were observed by the method of acetyl coenzyme A synthetase and acetyl coenzyme A oxidase (ACS-ACOD). The protein levels of total AMP-activated protein kinase (AMPK), phosphorylated AMP-activated protein kinase (p-AMPK), fatty acid translocase (FAT/CD36) and carnitine palmitoyltransferase I (CPT-1) were measured by Western blotting. RESULTS: No significant difference in each index between sham group and control group was observed. Compared with control group, LVEF and FS in model group was significantly decreased, while LVD and LVS was significantly increased (P<0.05). The LVEF and FS in APS group were significantly improved compared with model group (P<0.05), and there was no significant difference between APS group and control group. LVD and LVS in APS group were obviously improved compared with mo-del group (P<0.05), and the difference was significant compared with control group (P<0.05). Compared with control group, focal myocardial necrosis increased, and residual myocardial cells reduced in model group, while those was much better in APS group as compared with model group (P<0.05). The FFA concentrations in the serum and myocardium in model group increased significantly compared with control group (P<0.05), while those decreased significantly in APS group as compared with model group (P<0.05). The protein levels of p-AMPK, CPT-1, and cell membrane FAT/CD36 in model group decreased significantly compared with control group (P<0.05), and those in APS group increased obviously compared with control group (P<0.05). CONCLUSION: APS improves chronic heart failure by activating the AMPK pathway and promoting myocardial ingestion and utiliation of FFA.

Astragaluspolysaccharides; Free fatty acid; AMP-activated protein kinase; Chronic heart failure

1000- 4718(2015)01- 0028- 05

2014- 06- 27

2014- 11- 06

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30370673)； 湖北省教育廳科學(xué)研究計劃資助項目(No. B2013120;B2014062)； 十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項目(No. ZD2012037)

△通訊作者 Tel: 0719-8272543; E-mail： doctorsongjie@163.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.006