三叉神經痛大鼠三叉神經節內谷氨酸表達分布的研究

胡秀敏，江遠仕，張盛漲

(1.廣東醫學院，廣東湛江524023；2.廣東醫學院附屬福田區人民醫院汕頭大學第二附屬醫院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000；3.廣東醫學院附屬深圳市福田區人民醫院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000)

三叉神經痛大鼠三叉神經節內谷氨酸表達分布的研究

胡秀敏1，江遠仕2，張盛漲3

(1.廣東醫學院，廣東湛江524023；2.廣東醫學院附屬福田區人民醫院汕頭大學第二附屬醫院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000；3.廣東醫學院附屬深圳市福田區人民醫院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000)

目的研究三叉神經痛(TN)大鼠時其三叉神經節(TG)內谷氨酸(Glu)表達與分布的關系。方法皮下注射硝酸甘油構建三叉神經痛大鼠模型；應用免疫組化技術檢測大鼠三叉神經節Glu含量與分布。結果皮下注射硝酸甘油構建三叉神經痛大鼠的三叉神經節內Glu含量增多且其主要分布在三叉神經節表層。結論Glu可能與三叉神經痛發生有密切關系。

硝酸甘油；谷氨酸；三叉神經痛；三叉神經節

三叉神經痛(TN)是一種原發性神經痛，累及面部三叉神經一支或兩支分布區，表現為反復性、慢性頭痛。發作時表現為以面頰上下頜及舌部明顯的劇烈電擊樣、針刺樣、刀割樣或撕裂樣疼痛，突發突止，間歇期完全正常，可伴有惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀。目前三叉神經痛發病機制還不是很清楚。谷氨酸(Glu)是公認的神經系統興奮性遞質，它能通過谷氨酸受體參與三叉神經系統內的痛覺信息的傳遞[1]，Glu也是神經系統分布很廣泛的一種重要的神經遞質，廣泛參與各種神經的調節，可能與三叉神經痛的發作有密切聯系。

1 材料與方法

1.1 材料①實驗動物與分組：健康SD大鼠16只，體重220～260 g；由廣東省實驗動物中心提供動物編號：SCXK(粵)2013-0008。實驗動物合格證號：按體重均衡原則將大鼠隨機分成對照組(生理鹽水，n=8只)、模型組(硝酸甘油組，n=8只)，分別皮下注射硝酸甘油與生理鹽水后，1 h灌注取材。②主要試劑與儀器：硝酸甘油(廣州明興制藥有限公司，批號MC 2407)，兔抗鼠谷氨酸多克隆抗體(Millipore Corporation，一抗)，批號：2204896，PV-6001二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠三叉神經痛模型的建立參照Tassorelli等[2]皮下注射硝酸甘油，SD大鼠按10 mg/kg頸部皮下注射硝酸甘油。一般注射后5～10 min大鼠出現雙耳發紅、爬籠次數增多、后肢頻繁撓頭、煩躁不安等現象，約40 min后達到高峰。此現象可持續3～5 h，之后大鼠呈現蜷臥、活動減少狀態，此為造模成功。對照組大鼠皮下注射等體積生理鹽水，大鼠僅在20 min內略有撓頭現象，之后趨于正常，也未出現雙耳發紅、爬籠次數增多和其他煩躁不安現象。

1.2.2 免疫組化標本留取對照組在皮下注射生理鹽水、模型組注射硝酸甘油1 h后，然后用10%的水合氯醛以400 mg/kg給大鼠腹腔麻醉，打開胸腔，在心尖處剪一個小口，灌注針經左心室插入升主動脈，同時把右心耳剪開以便于血液以及灌注液流出，另一端接50 ml注射器，開始先用生理鹽水快速灌注大約500 ml生理鹽水至肝臟變白，右心流出生理鹽水，再注射約200 ml 4%的多聚甲醛(溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.4)溶液，灌注先快后慢大約20 min灌完，在灌注之前可以先注射適量肝素使血液肝素化。灌注過程中用止血鉗止住腹主動脈，固定后斷頭取三叉神經節，置于4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS液中固定4 h。全自動脫水機脫水后石蠟包埋，石蠟切片機切片，切片厚度為3μm，貼于APES硅膠防脫載玻片上，63℃12 h烤干備用。切片常規脫蠟至水，4罐二甲苯依次脫蠟8 min后無水乙醇(100%、95%、85%、75%)脫水依次3 min，熱修復抗原：將切片放入盛有0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)對抗原中進行修復，自然冷卻后PBS洗3遍，3%H2O2室溫孵以滅活內源性酶活性進行封閉，然后暗室室溫10 min，PBS洗3遍，滴加一抗(Anti谷氨酸抗體，兔抗大鼠1:2 000，購于Millipore Corporation)，4℃冰箱過夜，復溫30 min，PBS漂洗3次，每次2 min；滴加二抗(PV-6001北京中杉金橋生物有限公司)，室溫90 min，PBS漂洗3次，每次2 min；二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色，蒸餾水沖洗5 min，蘇木精復染1 min，梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗5 min，二甲苯透明,中性樹膠封片。陰性對照用0.01 mol/L的PBS代替一抗顯色，其他步驟不變，結果均為陰性。為了保證可比性，實驗組和對照組切片在同一反應條件、同一染缸中進行，其他反應條件保持不變。

1.3 圖像分析TG染色后，顯微鏡下拍照，用Image tool圖像分析系統觀察分析光密度。

1.4 統計學方法應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，計量數據均以均數±標準差(±s)表示，組間數據間的統計采用方差分析。以P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

皮下注射硝酸甘油組大鼠谷氨酸陽性免疫反應細胞主要分布在三又神經節表層細胞，TG的神經細胞內呈棕褐色染色，位于胞漿、胞核處，胞核素木蘇復染呈現藍色。注射生理鹽水組大鼠TG谷氨酸感覺神經元大部分呈現陰性反應。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統軟件分析Glu陽性神經元的光密度變化。硝酸甘油組和生理鹽水組陽性神經元的平均光密度分別為(0.354 5±0.257 1)和(0.166 2±0.064 3)。硝酸甘油組TG中Glu的表達較生理鹽水組明顯增加(F=403.387，P＜0.01)，見圖1。

圖1 谷氨酸在各組SD大鼠三叉神經節中的表達

3 討論

三叉神經痛是臨床上一種比較常見的疾病，具有廣泛的發病年齡，從10歲到90歲均可發病，其中以40歲以上的中年人居多，近年來兒童的發病率逐漸增加，女性多見。三叉神經痛以兩側或一側面部三叉神經分布區內反復發作的陣發性劇烈痛為主要表現，發作時表現為以面頰上下頜及舌部明顯的劇烈電擊樣、針刺樣、刀割樣或撕裂樣疼痛，突發突止，間歇期完全正常，可伴有惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀，嚴重影響患者的生命質量，被認為是人類最痛苦的疾病之一。三叉神經分為繼發性和原發性三叉神經痛，以后者多見，且發病機制與病因不明，可能涉及外周、中樞及免疫因素等。繼發性三叉神經痛是由于腫瘤、外傷、炎癥等原因引起的痛，目前臨床上雖然有多種治療方法，但效果均不理想。

本實驗通過硝酸甘油組與生理鹽水組作比照，硝酸甘油組Glu表達明顯高于生理鹽水組，通過Glu表達與分布揭示TN與Glu的密切關系。對神經遞質Glu與疼痛的研究，至今仍是社會研究的一個熱點，21世紀的大量研究表明，Glu在各種類型疼痛中均具有一定的重要作用，Glu作為神經系統內普遍存在的一種興奮型神經遞質，在口面部信息感覺的傳遞中同樣發揮重要作用。研究人員研究發現，谷氨酸是負責TN信息傳遞和調節的關鍵遞質而且口面部痛覺的異常敏化就伴隨三叉神經傳導路上谷氨酸釋放的異常增多[3-5]。有實驗表明，在大鼠組織發生炎癥或神經損傷所致的病理性疼痛時，外周或脊髓內谷氨酸水平升高[6]。

目前，臨床上治療TN方法也眾多，藥物品種更是繁多，藥物治療如普坦類佐米曲普坦可以抑制三叉神經神經元的興奮性，曾被喻為治療三叉神經痛的“金標準”[7]。手術治療如微血管減壓術、神經周圍支撕脫術、顱底神經高位切除切斷術、經皮穿刺射頻溫控熱凝治療等[8]，但效果均不理想，且容易復發。TN的理想術式是能做到選擇性毀損痛覺纖維，保留其他的感覺和運動纖維，減少并發癥，降低復發率。實施高度選擇性切斷三叉神經感覺跟(TNSR)上的痛覺纖維，保留其他感覺及運動纖維治療TN是基礎和臨床的重要課題，江遠仕等[9-10]開展TNSR的表層神經纖維束切斷術(STS)。術后患者痛覺消失，運動、溫度、觸壓覺功能保留尚完好，從臨床上證明了三叉神經痛的痛覺纖維可能位于三叉神經節的表層。

由本實驗推測，在三叉神經節表面初級傳入纖維中，谷氨酸可能作為一種神經遞質作用于突觸后膜上的谷氨酸受體而直接參與傷害性信息的傳遞，導致中樞敏化，從而導致大鼠三叉神經支配區面部和口腔疼痛。

綜上所述，Glu可能存在于三叉神經節的表層并且參與TN的病理生理過程，其與三叉神經痛發生有密切關系。

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Distribution of glutamic acid expression within the trigeminal ganglia in rats with trigeminal neuralgia.

HU Xiu-min1,JIANG Yuan-shi2,ZHANG Sheng-zhang3.1.Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong, CHINA;2.Department of Otolarynogology-Head and Neck Surgery,People's Hospital of Futian District of Shenzhen Affiliated to Guangdong Medical School,the Second Affiliated Hospital of Shantou University,Shenzhen 518000, Guangdong,CHINA;3.Department of Otolarynogology-Head and Neck Surgery,People's Hospital of Futian District of Shenzhen Affiliated to Guangdong Medical School,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the distribution of glutamate(Glu)expression within the trigeminal ganglia (TG)in rats with trigeminal neuralgia(TN).MethodsRats models with TG were constructed by subcutaneous injection of nitroglycerin trigeminal neuralgia.Immunohistochemical technique was applied to detect the contents and distribution of Glu.ResultsThe level of glutamic acid was found increased in trigeminal ganglion in the rat models, and it was mainly distributed in the surface layer of trigeminal ganglion.ConclusionGlu may have close relationship with TN.

Glyceryl trinitrate;Glutamate;Trigeminal neuralgia;Trigeminal ganglion

R-332

A

1003—6350（2015）01—0015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0005

2014-07-29)

廣東省自然科學基金（編號：040112155）；深圳市重點科研基金（編號：20110421225）

江遠仕。E-mail：jysh@163.com