S1P信號通路在肥厚心肌缺血后適應中的作用

李海霞，李曉梅，陳邦黨，劉芬，楊毅寧，蓋敏濤，陳小翠，馬依彤

(1.山東省中醫藥大學第二附屬醫院心內科，山東濟南250000；2.新疆醫科大學第一附屬醫院心臟中心冠一科，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫科大學第一臨床醫學院，新疆烏魯木齊830011)

·論著·

S1P信號通路在肥厚心肌缺血后適應中的作用

李海霞1，2，李曉梅2，陳邦黨3，劉芬3，楊毅寧3，蓋敏濤3，陳小翠3，馬依彤2

(1.山東省中醫藥大學第二附屬醫院心內科，山東濟南250000；2.新疆醫科大學第一附屬醫院心臟中心冠一科，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫科大學第一臨床醫學院，新疆烏魯木齊830011)

目的探討在缺血后適應(IPost)減輕肥厚心肌缺血再灌注(IR)損傷中S1P信號通路的作用。方法選取12周齡C57/BL小鼠，利用Langendorff灌流裝置建立小鼠肥厚心肌IR模型，30 min全心缺血隨后再灌注90 min。64只小鼠隨機分為缺血再灌注組(IR組)、缺血后適應組(IPost組)、IPost+W-146組和IPost+ PD98059組，每組14只，進行心臟血流動力學和心肌梗死范圍檢測，Western印跡方法檢測S1P1、ERK1/2總蛋白及磷酸化蛋白表達水平。脫氧核苷酸轉移酶介導的生物素原位缺口末端標記(TUNEL)法檢測心肌細胞的凋亡。結果與IR組比較，IPost組小鼠心臟血流動力學指標左心室收縮壓[(66±6)mmHg vs(85±5)mmHg]、左室壓力上升最大速度[(2 820±220)mmHg vs(3 778±230)mmHg]顯著降低(P＜0.05)，心肌梗死范圍顯著減小[(23.6±2.8)%vs (40.2±4.6)%]。IPost+抑制劑組顯示在再灌注的最初15 min使用W-146、PD98059能消除IPost對肥厚心肌的上述保護作用并顯著增加心肌梗死面積，與IR組水平相同。與IR組比較，IPost組在再灌注結束后心肌組織中的S1P1、ERK1/2蛋白磷酸化水平表達顯著增加；IPost+W-146組與IPost+PD98059組分別與IR組比較，上述指標差異均無統計學意義(P＞0.05)；TUNEL法檢測結果顯示，IPost組Bcl-2的表達較其他各組明顯升高，Bax的表達較其他各組明顯降低，經比較各組之間Bcl-2和Bax的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。結論IPost能有效地減輕離體小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷，IPost的心肌細胞保護作用可能是通過S1P結合S1P1后激活ERK1/2信號通路實現的。

S1P；S1P1；肥厚心肌；缺血再灌注；缺血后適應

缺血后適應(Ischemic postconditioning，IPost)能夠有效的減輕急性心肌梗死患者的再灌注損傷，是目前的研究熱點，尤其是探討S1P信號通路在IPost減輕肥厚心肌缺血再灌注(IR)損傷中的作用，一些學者紛紛著手該方面的研究，但均遇到一些瓶頸問題。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)是鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)產生的中間代謝產物，是重要的信號分子，在心血管系統方面發揮著重要作用，越來越受到人們的重視[1]，S1P是否參與肥厚心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其調節機制至今仍然不清楚[2]。本研究采用小鼠離體肥厚心臟模型，探討S1P在缺血后適應肥厚心肌中的作用，從而闡述明確IPost對肥厚心肌保護的作用機制，以便為臨床研究及其應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、儀器與試劑64只C57/BL小鼠(12周齡)，雄性，體重22～25 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。S1P1抑制劑W-146、ERKl/2抑制劑PD98059、氯化三苯四氮唑(Sigma，美國)。動物組織線粒體分離試劑盒(Genmed，美國)。生物素原位缺口末端標記(TUNEL)檢測試劑盒(Roche，美國)。主要儀器是呼吸機(Harvard 687，美國)、BL-420生理實驗記錄系統(中國武漢生產)。

1.2 實驗方法參照李曉梅等[3]的方法，對TAC手術后的4周小鼠給予麻醉，腹腔注射用量為1 000 U/kg的肝素，并從胸部正中切口，游離主動脈弓后快速分離心臟，用4℃的KH液[3]沖洗心臟，并將其主動脈弓移接到Langendorff灌流系統上。采用95%氧和5%二氧化碳氣化的KH液，在灌注壓80 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)、灌流液溫度37℃的條件下，以非循環方式灌注心臟。灌注30 min待心臟穩定以后，再經過30 min全心缺血和共計90 min繼續灌注。將心臟缺血30 min的小鼠隨機分成4組，每組16只，分別為：(1)缺血再灌注組(IR組)；(2)缺血后適應(IPost)組：恢復灌注前l min，缺血10 s后繼續灌注10 s，標定為1個周期，重復3次，總計60 s；(3)IPost+ W-146組(S1P1抑制劑)；(4)IPost+PD98059組(ERK1/2抑制劑)。在恢復再灌注的起始不進行IPost，分別給予W-146(濃度為10-3mmol/L)、PD98059(濃度為10-5mmol/L)的KH液持續灌注15 min后再恢復無PD98059及W-146的KH液灌注。各組IR結束后，進行心臟血流動力學、心肌梗死范圍檢測，Western印跡方法檢測S1P1、ERK1/2總蛋白及磷酸化蛋白表達水平，脫氧核苷酸轉移酶介導的生物素原位缺口末端標記(TUNEL)法檢測心肌細胞的凋亡。

1.3 統計學方法應用SPSS16.0統計學軟件來處理相關數據，計量數據以均數±標準差(±s)表示，計量資料間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組離體小鼠心臟血流動力學結果比較與IR組、IPost+W-146組與IPost+PD98059組相比較，IPost組小鼠心臟血流動力學指標左心室收縮壓、左室壓力上升最大速度顯著降低(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠心臟血流動力學指標(±s，mmHg)

表1 各組小鼠心臟血流動力學指標(±s，mmHg)

注：α表示與其他三組比較，IPost組的左心室收縮壓(mmHg)、左室壓力上升最大速度(mmHg)明顯降低(P＜0.05)。

組別左心室收縮壓左室壓力上升最大速度I R組I P o s t組I P o s t + W -1 4 6組I P o s t + P D 9 8 0 5 9組8 5 ± 5 6 6 ± 6a8 3 ± 4 8 4 ± 5 3 7 7 8 ± 2 3 0 2 8 2 0 ± 2 2 0a3 7 7 0 ± 2 2 5 3 6 6 9 ± 2 2 8

2.2 心肌梗死范圍的測定IPost組較IR組心梗面積明顯縮小[(23.6±2.8)%vs(40.2±4.6)%]，差異有統計學意義(P＜0.01)。而IR組[(40.2±4.6)%]、IPost+W-146組[(39.7±2.8)%]、IPost+PD98059組[(42.4±3.6)%]三組心肌梗死面積差異無統計學意義(P＞0.05)。可知應用W-146、PD98059對缺血再灌注心肌梗死范圍無影響，W-146、PD98059能夠消除IPost對心臟的保護作用。

2.3 ERK1/2蛋白表達和磷酸化狀態對以上4組離體心臟經過30 min缺血、90 min繼續灌注以后，各組蛋白表達差異沒有統計學意義(P＞0.05)。90 min IPost組的心肌p-ERK1/2表達較IR組明顯上升[(0.28±0.02)vs(0.08±0.03)，P＜0.05]，IR組、IPost+ W-146組、IPost+PD98059組的心肌p-ERK1/2表達差異無統計學意義(P＞0.05)。表明ERK1/2信號途徑參與介導肥厚心肌缺血后適應保護，見圖1。

2.4 S1P1蛋白的表達對以上4組離體心臟經過30 min缺血、90 min繼續灌注后，檢測心肌組織中S1P1蛋白表達差異。結果顯示與IR組比較，IPost組、IPost+W-146組及IPost+PD98059組的心肌S1P1表達明顯增加(P＜0.01)，見圖2。

圖1 Western blot檢測各組ERK1/2及磷酸化ERK1/2的水平

圖2 Western blot檢測各組小鼠離體肥厚心肌S1P1的水平

2.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡IPost組Bcl-2的表達較其他各組明顯升高(P＜0.05)，Bax的表達較其他各組明顯降低(P＜0.05)。IR組、IPost+ W-146組、IPost+PD98059組Bcl-2和Bax之間比較，其χ2值分別為26.48、29.06、34.85；P值分別為0.061、0.051、0.056，表明各組Bcl-2和Bax表達差異無統計學意義，見圖3。

圖3 Western blot檢測各組凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達

3 討論

缺血再灌注損傷是現在研究的熱點與難點課題，目前國內外研究資料顯示，脊髓、腦、心臟等器官在缺血發生后施行缺血后適應處理，能夠減少再灌注損傷，對機體起到保護作用，具有較高的臨床價值[4]。根據張健發等[5]研究發現，以小鼠為動物模型，在再灌注開始之前進行缺血后適應，與預適應一樣也可以減輕再灌注損傷。應用到臨床心肌梗死時，通過酶的釋放監測指標可以顯示心肌梗死程度面積減少，癥狀得到了減輕[6]。IPost的作用機制是：首先IPost能夠抑制中性粒細胞的聚集從而提高內皮細胞功能；其次抑制氧化應激，還能降低線粒體中Ca2+濃度，減少再灌注產生有害物質，從而減少對心肌細胞的損害；接著它能減輕心肌水腫，從而改善血管內皮的功能，然后減少心肌再灌注損傷[7]，達到保護心肌的作用。本研究發現，肥厚心肌IPost以后，心肌梗死的范圍明顯低于IR組，由此可知IPost在肥厚心肌缺血再灌注中起一定的保護作用。

本研究結果顯示，IPost組小鼠心臟血流動力學指標左心室收縮壓、左室壓力上升最大速度相比IR組顯著降低(P＜0.05)，其他三組差異無統計學意義。IPost組較IR組、IPost+W-146和IPost+PD98059能明顯降低肥厚心肌的心梗面積、改善心功能并能減少心肌細胞的凋亡率，增加Bcl-2的表達，降低Bax的表達，并且p-ERK、S1P1的表達上明顯升高，而加有W-146、PD98059的IPost組的心梗面積、心功能以及Bcl-2、Bax、p-ERK1/2和S1P1的表達較IR組差異無統計學意義，以上結果證明IPost對肥厚心肌缺血再灌注具有保護作用，并且此保護作用可能是通過S1P及ERK1/2信號通路實現的，這與國外的研究[8]一致。另外，根據研究[9]發現，S1P還可通過以下三個方面來保護心臟：一是減少肌酐酶釋放；二是改善血液動力學；三是能夠減少梗塞面積[10]。這需要進一步去研究和證實。

綜上所述，IPost能有效地減輕離體小鼠肥厚心肌缺血再灌注損傷，其作用可能是通過S1P結合S1P1后激活ERK1/2信號通路實現的，為急性心肌梗死合并左室肥厚患者減輕心肌缺血再灌注損傷、改善預后提供了一個新的治療思路，同時S1P受體及其信號傳導通路的激動劑或阻斷劑將成為一些疾病新的作用靶點，為預防和治療疾病提供新的思路。

[1]葛靜巖,張文杰,趙春燕,等.1-磷酸鞘氨醇對豚鼠心室肌細胞鈣通道的作用[J].吉林大學學報醫學版,2008,1(5):52-54.

[2]胡為民,楊健,唐恩潔.S1P1真核表達載體的構建及在HEK293細胞膜上的表達[J].川北醫學院學報,2008,23(1):28-29.

[3]李曉梅,楊毅寧,馬依彤,等.再灌注搶救激酶在肥厚心肌缺血后適應中的作用[J].中華高血壓雜志,2011,3(19):263-268.

[4]李躍艷,熊升林.1-磷酸鞘氨醇受體途徑誘導的心肌肥大及蛋白激酶C的調節作用[J].中國動脈硬化雜志,2011,7(3):573-577.

[5]張健發,馬依彤,楊毅寧,等.再灌注搶救激酶對小鼠缺血后適應心肌再灌注損傷中的減輕作用[J].中華心血管病雜志,2008,36 (2):161-167.

[6]Molkentin JD,Dorn II GW.Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy[J].Annual Review of Physiology, 2001,63(1):391-426.

[7]Sabri A,Hughie HH,Lucchesi PA.Regulation of hypertrophic and apoptotic signaling pathways by reactive oxygen species in cardiac myocytes[J].Antioxidants and Redox Signaling,2003,5(6): 731-740.

[8]Zhu M,Feng J,Lucchinetti E,et al.Ischemic postconditioning protects remodeled myocardium via the PI3K-PKB/Akt reperfusion injury salvage kinase pathway[J].Cardiovasc Res,2006,72(1): 152-162.

[9]Bujak M,Frangogiannis NG.The role of TGF-β signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling[J].Cardiovasc Res,2007, 74(2):184-195.

[10]Heineke J,Molkentin JD.Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2006,7(8):589-600.

Effects of ischemic postconditioning on hypertrophic myocardium by sphingosine-1-phosphate signal transduction pathways.

LI Hai-xia1,2,LI Xiao-mei2,CHEN Bang-dang3,LIU Fen3,YANG Yi-ning3,GAI Min-tao2, CHEN Xiao-cui3,MA Yi-tong2.1.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urümqi 830011,Xinjiang,CHINA;2.Heart Center,the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA;3.The First Clinical Medical College of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of ischemic postconditioning(IPost)in protecting hypertrophic myocardium subjected to ischemic re-perfusion(IR)and to study the role of Sphingosine-1-phosphate in mediating such protection.MethodsTransverse aortic constriction(TAC)operation was performed on 12-week-old C57/ BL mice to establish left ventricular hypertrophy models.Sixty-four isolated TAC mouse hearts were mounted onto the Langendorff perfusion system and equally divided into four groups:IR group[undergoing stable perfusion for 30 min,ischemic for 30 min,and re-perfusion for 90 min(an IR cycle)to cause hypertrophic myocardium IR injury],IP-ost group[undergoing ischemic for 10 s and re-perfusion 10 s,totally 3 cycles(60 s)before re-perfusion for 90 min], IPost+W-146 group and IPost+PD98059 group.Hemodynamic examination was conducted 90 min after re-perfusion to measure the left ventricular systolic pressure(LVSP),left ventricular end diastolic pressure(LVEDP),maximal uprising velocity of left ventricle pressure(dp/dtmax),and minimal uprising velocity of left ventricle pressure(dp/dtmin).After the IR procedure the myocardium of the left ventricle was isolated to detect the infarction size(IS).Western blotting was used to detect the protein expression of S1P1,ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2.TUNEL was used to detect the apoptosis rate.ResultsCompared with IR group,the LVSP levels of the IPost group were significantly higher[(66±6)mmHg vs(85±5)mmHg],the dp/dtmax were significantly decreased[(2 820±220)mmHg vs(3 778±230)mmHg],and the infarction size was significantly reduced[(23.6±2.8)%vs(40.2±4.6)%],all with P＜0.05. However,the results of the IPost+inhibitor groups(IPost+W-146 group and IPost+PD98059 group)showed that in the first 15 min of re-perfusion addition of W-146 and PD98059 reversed all changes observed in the IPost group and eliminated the IPost protection by increasing infarction size to a level similar to that in the IR group.Compared with the IR group,the protein levels of S1P1,phosphorylated ERK1/2 of the IPost group were all significantly higher.IP-ost+W-146 group and PD98059 group showed no statistically significant difference with the IR group in the above-mentioned parameters(P＞0.05).Results of TUNEL assay test showed that the expression of IPost group's Bcl-2 was significantly higher than the other groups,and the expression of Bax was significantly lower than the other groups(P＜0.05).ConclusionIPost has protective effect in hypertrophic myocardium with IR injury in vitro.The cardioprotective effects of IPost may involve in the regulation of ERK1/2 signal pathway through S1P signal transduction pathway.

Sphingosine-1-phosphate;Sphingosine-1-phosphate receptor 1;Hypertrophic myocardium; Ischemic re-perfusion;Ischemic postconditioning

R-332

A

1003—6350（2015）01—0001—04

2014-04-22)

國家自然科學基金(編號：81060021)；國家教育部高等學校博士學科專項科研基金(新教師基金，編號：20106517120001)；新疆自治區高校科研計劃科學研究重點項目(編號：XJEDU20-10I29)；新疆醫科大學第一附屬醫院科研專項基金(編號：2010YGY007)

李曉梅。E-mail：lixm505@163.com