液相色譜－串聯質譜法檢測牛奶中苯并咪唑類藥物

（北京市飼料監察所）

苯并咪唑類藥物是一類含有2 個氮原子的雜環化合物，自20世紀80年代初問世以來，相繼合成了許多廣譜、高效、低毒的藥物，其中主要的有甲苯咪唑、阿苯噠唑、噻苯咪唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑等。它們的基本作用相似，主要對線蟲具有較強的驅殺作用，有的不僅對成蟲，而且對幼蟲也有效。但這類藥物具有致畸作用，對人類也可引起與動物同樣的潛在危害。隨著苯并咪唑類藥物的廣泛應用，其產生的毒副作用還會對人體產生直接的危害，因而苯并咪唑類藥物在牛奶中的殘留問題已經日益引起人們的關注。

1 檢測過程

牛奶中的苯并咪唑類藥物經乙酸乙酯提取，氮氣吹干后用酸化乙醇復溶，正己烷脫脂；經MCX陽離子固相萃取小柱凈化，氨化甲醇洗脫后氮氣吹干，殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液復溶，過0.22 μm濾膜后供液相色譜－串聯質譜儀測定。

2 試劑和儀器設備

2.1 試劑

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682規定的一級水。

阿苯噠唑、阿苯噠唑砜、阿苯噠唑亞砜、胺基阿苯噠唑、噻苯咪唑、5-羥基噻苯咪唑、甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、芬苯噠唑、芬苯噠唑砜、奧芬噠唑、氟苯咪唑和2-胺基-氟苯咪唑等苯并咪唑類藥物及其代謝物混合標準工作液（10 μg/mL），由中國獸醫藥品監察所提供；乙酸乙酯；氯化鈉；乙醇；鹽酸；正己烷；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；50%甲酸甲醇溶液，取甲酸50 mL加甲醇至100 mL，混勻即得；2%碳酸鈉水溶液，稱取碳酸鈉2 g，用水溶解并稀釋至100 mL，混勻即得；酸化乙醇溶液（乙醇+0.1 mol/L鹽酸溶液，V/V＝2∶1），量取乙醇20 mL加入0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL，混勻即得；5%氨水甲醇溶液，取氨水5 mL加甲醇至100 mL，混勻即得；20%甲醇+0.1%甲酸水溶液，量取甲醇20 mL和甲酸0.1 mL，用水溶解并稀釋至100 mL，混勻即得；0.1%甲酸乙腈溶液，取甲酸0.1 mL加乙腈至100 mL，混勻即得；0.1%甲酸水溶液，取甲酸0.1 mL加水至100 mL，混勻即得；0.1 mol/L鹽酸溶液，取鹽酸9 mL加水稀釋至1 000 mL，混勻即得。

2.2 主要儀器與設備

液相色譜－串聯質譜儀，Waters公司2695-Quattro micro，配電噴霧離子源；分析天平（感量0.01 g），AR3130；電子天平（感量0.0001 g），AX-105；固相萃取裝置；氮吹儀；旋渦混合器；高速冷凍離心機，D-37520型；離心管，50 mL；玻璃試管，10 mL；MCX固相萃取柱，60 mg/3 cc；微孔濾頭，0.22 μm。

2.3 線性試驗

2.3.1 標準溶液的配制

（1）苯并咪唑類藥物及其代謝物標準儲備液（1 mg/mL）

準確稱取適量的5-羥基噻苯咪唑、噻苯咪唑、胺基阿苯噠唑砜、阿苯噠唑亞砜、阿苯噠唑砜、奧芬噠唑、羥基甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、2-胺基-氟苯咪唑、芬苯噠唑砜、甲苯咪唑、阿苯噠唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑對照品，用50%的甲酸甲醇溶液分別配制成1 mg/mL的標準儲備液。配制完后，-20 ℃保存。

（2）苯并咪唑類藥物及其代謝物混合標準工作液（10 μg/mL）

分別準確吸取5-羥基噻苯咪唑、噻苯咪唑、胺基阿苯噠唑砜、阿苯噠唑亞砜、阿苯噠唑砜、奧芬噠唑、羥基甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、2-胺基-氟苯咪唑、芬苯噠唑砜、甲苯咪唑、阿苯噠唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑標準儲備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻即得。配制完后，4 ℃保存。

（3）苯并咪唑類藥物及其代謝物混合標準工作液（1 μg/mL）

準確吸取苯并咪唑類藥物及其代謝物混合標準工作液（10 μg/mL）1.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻即得。配制完后，4 ℃保存。

2.3.2 樣品的制備

（1）提取

稱取（2±0.02）g試料加入2%碳酸鈉溶液0.5 mL，再加入氯化鈉2 g，加入乙酸乙酯8 mL，渦旋混合后，中速振蕩提取5 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液，重復提取一次，合并上清液至離心管中。40 ℃下吹至近干，向離心管中加入酸化乙醇溶液5 mL，渦旋混合1 min，超聲5 min，再向離心管中加入正己烷5 mL，渦旋混合1 min，6 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷。再用正己烷5 mL重新脫脂一次，下層溶液作為備用液。

（2）凈化

MCX小柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化，取全部備用液過柱，控制流速為1 mL/min，依次用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL以同樣速度淋洗柱子，抽干，用5%氨水甲醇溶液3 mL洗脫于試管內；洗脫液于40 ℃下氮氣吹干。

殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL，超聲10 min，充分渦旋混勻；過0.22 μm濾膜后供液相色譜－串聯質譜儀測定。

2.3.3 測定

（1）液相色譜條件

色譜柱：Waters Xterra C18柱，（2.1×50）mm，1.7 μm；流動相：A相，0.1%甲酸乙腈溶液，B相，0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：洗脫程序見表1；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。（2）質譜參考條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；電離電壓：3.0 kV；源溫：110 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：450 L/h；測試藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量，結果見表2。

（3）標準曲線繪制

以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，對照溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3.4 線性試驗測定結果

表1 梯度洗脫程序

表2 苯并咪唑類藥物及其代謝物定性、定量離子對，錐孔電壓、碰撞能量和保留時間

線性試驗測定結果如表3所示。

從線性回歸方程及相關系數R2可以看出，14 種苯并咪唑類藥物及其代謝物在10～1 000 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2均大于0.99。

2.4 靈敏度試驗

2.4.1 靈敏度試驗方法

分別準確吸取1 μg/mL混合標準工作液10和20 μL，添加到2 g牛奶中，制得濃度為5 μg/kg和10 μg/kg的空白添加試料。按樣品提取與凈化步驟處理，殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL溶解，充分超聲、渦旋混勻，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜－串聯質譜測定，計算信噪比。空白試樣按同樣的方法處理，得到空白試樣的質量色譜圖。

2.4.2 靈敏度試驗結果

空白牛奶試樣的測定結果表明，在相應的保留時間均無雜質干擾。檢測限（LOD）考察結果：按信噪比S/N＞3（PtP）計，苯并咪唑類藥物及其代謝物在5 μg/kg的添加水平上均符合要求，說明苯并咪唑類藥物及其代謝物的檢測限均能達到5 μg/kg。定量限（LOQ）考察結果：按信噪比S/N＞10（PtP）計，苯并咪唑類藥物及其代謝物在10 μg/kg的添加水平上均符合要求，說明苯并咪唑類藥物及其代謝物的定量限均能達到10 μg/kg。

表3 苯并咪唑類藥物回歸方程及相關系數（R2）

2.5 準確度和精密度考察

2.5.1 試驗方法

采用標準添加法，在空白牛奶10、50、100和200 μg/kg共4 個不同濃度的苯并咪唑類藥物及其代謝物，進行回收率試驗，各濃度進行5 個樣品平行試驗。按樣品提取與凈化步驟處理，殘余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL溶解，充分渦旋混勻，過膜后供高效液相色譜－串聯質譜測定。重復3 次，求批內、批間相對標準偏差。

2.5.2 結果計算

式中：X—供試試料中苯并咪唑類藥物及其代謝物殘留量（μg/kg）；Cs—基質匹配溶液中相應苯并咪唑類藥物及其代謝物濃度（ng/mL）；C—供試試料溶液中相應苯并咪唑類藥物及其代謝物濃度（ng/mL）；As—基質匹配溶液中相應苯并咪唑類藥物及其代謝物峰面積；A—供試試料溶液中相應苯并咪唑類藥物及其代謝物峰面積；V—殘余物定容體積（mL）；m—供試試料質量體積（g或mL）。

需要注意的是，計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留3 位有效數字。

2.5.3 準確度和精密度試驗

準確度和精密度試驗結果見表4。由表4可知，在10、50、100和200 μg/kg添加濃度水平上，本方法在空白牛奶中的回收率平均為70%～120%。批內、批間相對標準偏差均小于20%。

3 結果與討論

3.1 線性范圍

苯并咪唑類藥物及其代謝物標準溶液在10～1 000 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2均大于0.99，符合要求。

3.2 靈敏度

苯并咪唑類藥物及其代謝物在牛奶中的檢測限能達到5 μg/kg，定量限能達到10 μg/kg，均符合要求。

3.3 準確度

本方法在10、50、100和200 μg/kg添加濃度范圍內，牛奶中苯并咪唑類藥物及其代謝物的回收率均在70%～120%范圍內，符合要求。

3.4 精密度

本方法在10、50、100和200 μg/kg添加濃度水平上，牛奶中苯并咪唑類藥物及其代謝物的批內相對標準偏差均≤20%，批間相對標準偏差均≤20%，符合要求。

表4 空白牛奶中苯并咪唑類藥物添加回收率試驗（n=5）

3.5 檢測方法的制定原因

為加強獸藥殘留監控工作，保證動物性食品衛生安全，農業部于2002年發布第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規定了甲苯咪唑、阿苯噠唑、噻苯咪唑、氟苯咪唑、芬苯噠唑及主要代謝物在牛奶中的最高殘留限量（MRL）。動物源產品中苯并咪唑類藥物殘留的檢測方法，報道的有高效薄層色譜（HPTLC）等初篩方法、高效液相色譜熒光檢測器測定方法（HPLC-FLD）、高效液相色譜質譜聯用（LC-MS和LC-MS｜MS）等測定方法。由于LCMS/MS方法具有操作簡捷、靈敏度高、定性準確等優點，所以將其應用于牛奶中苯并咪唑類藥物及其代謝物殘留檢測方法的研究中，以保障對該類獸藥的殘留監控。

3.6 樣品處理方法的確定

苯并咪唑類藥物屬于弱堿類化合物，在弱堿性條件下，呈游離分子狀態，在酸性條件下，該類化合物質子化。因此本方法提取時采用堿性條件下用乙酸乙酯進行提取。

由于大多數苯并咪唑類藥物溶于乙醇和稀鹽酸溶液，因此本方法在合并2 次提取液濃縮蒸干后，采用了酸化乙醇溶液溶解濃縮物，既可以脫去提取樣品中的蛋白質，也可以充分溶解該類藥物，進一步經正己烷脫脂后通過固相萃取方法進行凈化。對固相萃取柱C18柱、HLB柱、MCX柱等進行比較發現：HLB和MCX的藥物添加回收率普遍較C18高；HLB和MCX之間差異不顯著，但是使用HLB時，酸性乙醇溶液溶解的濃縮物在上樣前需用碳酸鈉溶液中和至中性，而使用MCX柱時，酸性乙醇溶液溶解的濃縮物可以直接過柱，因此操作起來比較方便，所以最終選擇了用MCX固相萃取柱進行凈化。

因此，本方法采用MCX柱，用甲醇、2%甲酸水溶液活化后，將提取液全部過柱，然后用5%氨化甲醇溶液洗脫，達到了理想的效果。另外，樣品經氮吹儀濃縮、吹干后要充分超聲溶解。

3.7 離子對的確定

苯并咪唑類藥物屬于歐盟指令96/23/EC附錄IB組所列物質，根據歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質至少需要3 個識別點（IP），分別選擇了母離子以及對應的2 個響應較強的子離子作為定性依據，這樣1 個母離子獲得1 個IP點，對應2 個子離子分別獲得1.5 個IP點，達到了4 個IP點，很好地滿足了歐盟有關法規的要求。