樹突狀細胞激活介導副干酪乳桿菌L9對CD4+T細胞的分化作用研究

文/楊 景 劉松玲 葛紹陽 劉 力 桑 躍 武永超 張建銘 劉治麟 趙 亮,*

（1中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京市高等學校畜產品工程研究中心；2江西鴻燕健康科技有限公司；3北京和益源生物技術有限公司）

CD4+T細胞在機體細胞免疫系統中有重要作用，初始CD4+T細胞（Na?ve CD4+T）在機體內不同細胞因子的作用下，分化為一系列具有不同功能的細胞群。樹突狀細胞（Dendritic Cells，DCs）是目前已知的體內功能最強的抗原呈遞細胞，在機體的免疫調節中有重要功能。CD103+DCs，作為一種重要的調節性樹突狀細胞（regDCs），可通過分泌視黃酸和轉化生長因子-β（TGF-β）等細胞因子，促進na?ve CD4+T細胞向調節性T（Foxp3+Treg）細胞分化，在調節機體內的Th1/Th2免疫失衡和維持機體免疫自穩中起重要作用[1]。

益生菌可調節腸道微生態的平衡和腸黏膜免疫系統。研究表明，益生菌可以通過提高小鼠淋巴細胞中Foxp3+Treg細胞數量，調節小鼠炎癥反應中的T細胞平衡[2]，而這種調節作用與其誘導DCs成熟、分化有關。已有研究表明，益生菌可以與DCs表面Toll樣受體或C型凝集素受體等結合，誘導DCs成熟及細胞因子的分泌[3]，進而增加機體內Foxp3+Treg細胞數量，緩解風濕、腸炎和過敏性哮喘等免疫失衡性疾病癥狀[4，5]。

副干酪乳桿菌L9分離自健康人腸道。課題組前期研究表明，L9具有調節小鼠腸道免疫功能的生物學活性[6]。然而，L9是否通過調節DCs功能，促進CD4+T分化發揮免疫調節生物學活性尚不清楚。因此，本研究以骨髓源樹突狀細胞（BMDCs）為模型，研究L9對其細胞因子的分泌及CD103表達的影響，利用L9誘導后的BMDCs與小鼠脾CD4+T細胞聯合培養，分析Foxp3+Treg細胞比例。

1 材料與方法

1.1 菌株

副干酪乳桿菌L 9（曾用名L14）由教育部功能乳品重點實驗室提供。將實驗菌株L9接種至MRS培養基中，37 °C培養至生長穩定期（12 h），將菌液4 500 r/min離心10 min后，用滅菌的0.01 mol/L、pH值7.4 PBS緩沖液重懸，調整菌液濃度為1.0×1010CFU/mL，100 ℃水浴30 min，經檢驗無活菌存在，且菌株保持正常形態。

1.2 試驗動物

本研究動物為SPF級BALB/c小鼠，體質量18～22 g，6 周齡。飼養于中國農業大學食品學院動物房，環境溫度24 ℃，濕度40%～60%，光照12 h，試驗前靜養1 周左右。

1.3 試劑

淋巴細胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限責任公司產品；細胞因子檢測試劑盒為R&D公司產品；RPM1640培養液購自美國Gibco公司；絲裂酶素C購自美國Sigma公司；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白細胞介素4（rmIL-4）購自美國Peprotech公司；流式抗體購自美國ebioscience公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 骨髓源樹突細胞分離與培養

提取小鼠骨髓細胞，添加rmGM-CSF、rmIL-4誘導6 天后，收集細胞為BMDCs。調整細胞密度為2.0×106CFU/mL，接種于6 孔板中。設置空白組（CON），陽性對照組（LPS，1 μg/mL；Pam3C，1 μg/mL）和2 個試驗組（L9菌懸液，一組濃度為1.0×106CFU/mL，一組為1.0×107CFU/mL）。每孔總體積為3 mL，每組設置3 個重復。連續培養24 h后，將細胞懸液離心，收集上清液用于細胞因子檢測，收集細胞用于流式分析及后續實驗。

1.4.2 樹突狀細胞與小鼠脾CD4+T細胞共培養

收集各組BMDCs，經絲裂霉素C滅活處理30 min，然后與小鼠脾淋巴細胞分離的CD4+T細胞（2.0×106CFU/mL）共培養（BMDCs︰CD4+T cell=1︰10），60 h后收集細胞，用于流式分析。

1.4.3 樹突狀細胞中CD103表達及CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例檢測

收集各組BMDCs，添加單抗標記CD11c（FITC）、CD103（PE）和MHCII（PerCP-eFluor710），4 ℃下避光30 min，PBS緩沖液清洗，然后細胞懸浮于PBS緩沖液中，通過流式細胞儀檢測CD103表達情況。

收集與樹突狀細胞共培養后的小鼠脾CD4+T細胞，添加單抗標記CD4（FITC），CD25（PE）和Foxp3（APC），通過流式細胞儀檢測其表面抗原分子的表達情況，分析CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例。

1.4.4 細胞上清液中細胞因子水平檢測

測定BMDCs細胞上清液中TGF-β和IL-10濃度，按照各ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.5 數據處理

采用SPSS12.5統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan’s multiple-comparison test分析組間差異，以P<0.05為顯著性，各組數據以Mean±SD表示。

2 結果與討論

2.1 L9 調節骨髓源樹突狀細胞因子分泌

樹突狀細胞可分泌調節性細胞因子，參與機體的免疫調節。由圖1可以看出，與空白對照組相比，L9能夠顯著促進BMDCs分泌調節性細胞因子IL-10和TGF-β，且有劑量效應。高劑量L9促進TGF-β分泌增加了3.03 倍，高于陽性對照組；同時促進IL-10分泌增加了26.58 倍。

近年來的研究發現，DCs不僅是體內重要的抗原遞呈細胞，而且對機體免疫反應發揮著重要的調節作用。在自身免疫性疾病中，分泌高水平調節性細胞因子（IL-10和TGF-β）的調節性DCs能夠促進自身反應性淋巴細胞凋亡和誘導Treg細胞的生成，抑制多種炎性細胞因子的分泌，從而維持機體免疫耐受[1]。益生菌具有調節機體內細胞和體液免疫應答的功能，能夠維持機體免疫系統健康和穩定。有研究發現，益生菌可以與DCs表面受體結合（如Toll樣受體，C型凝集素受體等），誘導DCs功能，但存在菌株差異性[3，7]；益生菌可以提高小鼠腸系膜淋巴結的調節性DCs中IL-10和TGF-β的mRNA表達，促進Treg細胞增多，緩解小鼠腸道炎癥[4]；長雙歧桿菌可以調節BMDCs成熟狀態，促進IL-10和TGF-β分泌，調節機體內Treg細胞增多，緩解小鼠花粉過敏反應[5]。

圖1 L9 對骨髓源樹突狀細胞分泌細胞因子的影響

本研究結果表明，L9可以促進BMDCs分泌調節性細胞因子IL-10和TGF-β，具有調節CD4+T細胞向Foxp3+Treg細胞分化的潛能。

2.2 L9 調節骨髓源樹突狀細胞 中CD103表達

圖2 L9對骨髓源樹突狀細胞中CD103表達的影響

CD103+DCs是參與機體免疫調節的一類重要的調節性DCs，可分泌調節性細胞因子，促進機體內Foxp3+Treg細胞的產生[1]。本研究中，采用流式細胞術分析了樹突狀細胞中CD103的表達，如圖2所示，與空白組相比，L9能夠顯著促進BMDCs中CD103的表達，且高劑量L9組中CD103表達的升高幅度達87.06%，高于陽性對照組。

機體內的DCs有許多不同亞型，其中CD103+DCs是一種重要的調節性DCs，參與調節許多炎癥反應。腸黏膜層的CD103+DCs可以通過TGF-β和視黃酸代謝途徑促進naive CD4+T細胞向Treg細胞分化[2]。有研究表明，食物過敏小鼠的腸組織淋巴細胞中CD103+DCs細胞比例降低[8]，證實了CD103+DCs在調節機體免疫耐受方面的重要性。益生菌與CD103+DCs相關研究表明，用雙歧桿菌灌胃小鼠，可提高小鼠腸道中CD103+DCs分泌IL-10水平，促進Treg細胞的產生，緩解小鼠腸道炎癥反應[9]。相似實驗表明，益生菌雖然可以促進DCs中IL-10和TGF-β的mRNA表達，但CD103+DCs細胞比例并沒有顯著變化[4]。

在本研究中，L9不但促進了BMDCs中IL-10和TGF-β的分泌，還促進了CD103的表達，表明L9可以通過提高CD103+DCs細胞數量來參與調節機體的免疫平衡。

2.3 L9 調節CD4+T 細胞向Foxp3+Treg 細胞分化

調節性DCs可以促進機體內Foxp3+Treg細胞分化，參與機體的免疫調節。為了更全面地研究L9對DCs功能的促進作用，采用L9誘導后的BMDCs與小鼠CD4+T 細胞聯合培養，使用流式細胞術分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例。由圖3可以看出，與空白組相比，L9組小鼠CD4+淋巴細胞中CD25＋－Foxp3+Treg細胞比例顯著增加，且以高劑量L9組增加幅度最大。結果表明，L9刺激后的BMDCs能夠促進過敏小鼠CD4+T 細胞中Foxp3的表達，可以調節機體T淋巴細胞平衡。

圖3 L9 對小鼠CD4+T 細胞中CD25+ Foxp3+Treg 細胞數量的影響

Foxp3+Treg細胞可以調節T細胞平衡，在建立機體免疫耐受及緩解炎癥反應中起到關鍵性作用。研究表明，益生菌可以提高小鼠體內Foxp3+Treg細胞的數量，緩解炎癥反應[4,10]。機體內na?ve CD4+T細胞向Foxp3+Treg細胞分化與CD103+DCs功能有關[2]。本研究結果表明，L9誘導的BMDCs提高CD4+T中Foxp3+Treg細胞比例，證明L9可以通過誘導DCs功能，參與Foxp3+Treg細胞介導的免疫調節作用。

3 結論

以骨髓源樹突狀細胞（BMDCs）為模型，研究了L9對DCs功能的影響。研究表明，L9促進BMDCs分泌調節性細胞因子（IL-10和TGF-β），提高CD103表達，可以誘導Foxp3+Treg細胞分化。由此可見，L9可以通過調節DCs分泌調節性細胞因子，誘導機體偏向Foxp3+Treg型細胞免疫應答。本研究結果揭示，L9的免疫調節活性與其提高CD103表達有關，但其分子免疫學機制還不是很清楚，有待于進一步研究。

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