粉被蟲草乙酸乙酯部化學成分研究

摘 " 要 " 用液體靜置發酵的方式培養粉被蟲草菌絲體，用75%酒精提取，利用萃取、柱層析、結晶、重結晶等方法，對粉被蟲草菌絲體的化學成分進行了分離、純化，采用核磁等手段對分離到的物質進行鑒定。結果從粉被蟲草乙酸乙酯部分分離出6個物質，將其中2個鑒定為腺嘌呤、尿苷，均為首次從粉被蟲草中分離得到。

關鍵詞 " 粉被蟲草;化學成分;乙酸乙酯;腺嘌呤;尿苷

中圖分類號：O656.2 " 文獻標志碼：A " 文章編號：1673-890X（2015）25-050-03

知網出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20150930.2333.040.html 網絡出版時間：2015/9/30 23：33：00

粉被蟲草（Cordyceps pruinosa Petch）與冬蟲夏草同屬隸屬于真菌界（Fungi），子囊菌門（Asomycotsa），子囊菌綱（Ascomycetes），糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae），肉座菌目（Hypocreales），麥角菌科（Clavicipitaceae），蟲草屬（Cordyceps），廣泛分布于世界各地[1]。粉被蟲草民間常作為藥物使用，以往研究表明其具有抗輻射[2-3]、抗真菌、抗細菌[4]、免疫調節[5]及調節心血管系統等作用[6];近期研究表明，其甲醇提取物通過抑制NF-κB依賴的炎癥基因的表達來抑制炎癥，暗示其有治療內毒素性休克或敗血癥的潛在價值[7]，在食品、醫藥領域有廣泛應用前景[6]。但是目前關于粉被蟲草化學成分、活性成分的報道非常少，從粉被蟲草僅分離到幾個化合物：N6-（2-羥乙基）-腺苷[8]、多糖ps1、多糖ps2[9]、一種分子式為C26H32O9的天然色素[10]和蟲草素[11]。

粉被蟲草的很多藥理作用都是建立在其粗提物上，其藥效物質基礎還未弄清，其化學成分也不清楚，限制了這一資源蟲草的深度開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

粉被蟲草GZUCC 8552菌株保藏于教育部西南藥用生物資源工程研究中心。

1.1.2 供試培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g切塊，水煮沸30 min，過濾取汁，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水補足1000 mL，pH自然。

種子培養基：蔗糖10 g、葡萄糖5 g、甘油10 g、黃豆粉5 g、酵母膏1 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂10 g、氯化鉀0.5 g、7水硫酸亞鐵0.01 g、水1000 mL。

液體發酵培養基：蛋白胨10 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀1 g、磷酸氫二鉀0.5 g、水1000 mL、pH值自然。

以上培養基均在0.1 MPa，121 ℃的條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 試劑

試劑均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器與設備

XT-2型雙目顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司），溫度計未校正;EI-MS用HP-5973型質譜儀（HP，美國）測定;ESI-MS由HP1100MSD型質譜儀（HP，美國）測定;核磁共振譜用取OVA-400核磁共振儀（Varian，美國）測定，TMS為內標。柱層析用硅膠（40～80目、200～300目、300～400目，硅膠H），薄層層析用硅膠（GF254）及GF254薄層層析板均為青島海洋化工廠分廠產品;大孔樹脂AB-8，天津市津達正通環保科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粉被蟲草菌絲體的發酵制備

按照前述培養方法，于室溫（約20℃）靜置培養120 d，菌絲體用蒸餾水洗滌后，60℃烘干，粉碎過60目篩，備用。

1.2.2 粉被蟲草次生代謝產物的提取和分離

3 kg粉被蟲草干粉─→75%乙醇，1∶8料液比，超聲30 min，提取3次─→濾液減壓濃縮合并成懸液─→上AB-8凝膠柱─→0%，10%，30%，50%，70%，100%乙醇梯度洗脫組分─→將除30%乙醇部分合并減壓濃縮，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取（萃取值無色），減壓濃縮得到4個萃取部分，對氯仿和乙酸乙酯部分進行分離。

將乙酸乙酯部分，用適量硅膠拌勻，用石油醚、丙酮按100∶0， 50∶1， 20∶1， 5∶1，1∶1上硅膠柱（200～300目）梯度洗脫，每個濃度洗3個柱體積;各部分合并減壓濃縮，上小硅膠柱（300～400目），用石油醚、丙酮按70∶1， 30∶1， 15∶1， 8∶1， 3∶1進行梯度洗脫，分段收集。

1.2.3 粉被蟲草化學成分的鑒定

對分離到的化合物，綜合運用現代波譜技術（EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT等）和熔點儀等傳統手段進行結構鑒定。

2 結果與分析

經反復的柱層析，結晶與重結晶，分離純化化合物。乙酸乙酯部分：在大柱石油醚、丙酮（50∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（30∶1）段分得物質1，小柱石油醚、丙酮（15∶1）段分得物質2;在大柱石油醚、丙酮（20∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（1∶1）段分得物質3;在大柱石油醚、丙酮（5∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（8∶1）段分得物質4，小柱石油醚、丙酮（15∶1）段分得物質5;在大柱石油醚、丙酮（1∶1）部分，小柱石油醚、丙酮（3∶1）段分得物質6。

從粉被蟲草菌粉中分離到6個物質，對較純的物質3， 6進行了結構鑒定，其理化特性和波譜數據依次如下。

化合物1：白色粉末。EI-MS m/z 136.1 [M + H]+。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6， δ） 8.12（2H， br.s， 2， 8-H）， 7.12（2H ， s， 6 -NH2）。13C-NMR（100 MHz， DMSO-d6， δ）： 155.8 （C-6）， 152.4 （C-2）， 150.3 （C-4）， 139.0 （C-8）， 118.5 （C-5）。以上數據與陳泉等（2002）[12]報道一致，鑒定其為腺嘌呤。

化合物2：白色粉末。EI-MS m/z 267.0 [M + Na]+。1H NMR （1 MHz， DMSO） δ： 7.9 （1H， d， J=8.5Hz， H-6）， 5.8 （1H， d，J=4.5Hz， H-1′）， 5.7 （1H， d， J=8.5Hz， H-5）， 3.8 （1H， m， J=12.0， 2.5Hz， H-5′a）。13C NMR （101 MHz， DMSO）δ： 163.3 （C-4）， 150.9 （C-2）， 140.9 （C-6）， 101.9 （C-5）， 87.8 （C-1′）， 84.8 （C-4′）， 73.6 （C-3′）， 70.0（C-2′）， 60.9 （C-5′）。以上數據與鄧雁如等（2005）[13]報道一致，鑒定其為尿苷。

3 結論與討論

采用液體靜置培養的方式發酵粉被蟲草菌絲體，用75%酒精對菌粉進行超聲提取，經萃取、反復柱層析進行分離純化，從乙酸乙酯部分分離出6個物質，其中2個經核磁鑒定為腺嘌呤、尿苷，均為首次從粉被蟲草中分離得到。

腺嘌呤是核酸中發現的2個重要嘌呤之一，它是含有氮原子共軛體系的雜環化合物，在基因表達和基因復制中起著主要作用，具有誘導植物細胞伸長生長的功能[14]。

尿苷，參與糖原合成，有助于提高細胞的耐缺氧能力;它也是構成動物細胞核酸的成分，能提高機體抗體水平。尿苷和肌苷等合用能促進心肌細胞代謝，加速蛋白質、核酸生物合成和能量產生，可促進和改善腦細胞代謝;還可以用來阻斷各種癌細胞和病毒的基因合成，治療癌癥和由病毒引起的疾病[15]。

目前關于粉被蟲草的化學成分、活性成分的報道非常少，在蟲草屬其他相近種中也有相似成分報道，比如冬蟲夏草中和蛹蟲草中也含有腺嘌呤、尿苷[16-17]。因此，粉被蟲草可以作為冬蟲夏草的替代品。

粉被蟲草作為藥物在民間長期使用，本身有多種生理作用，但是其藥效物質基礎并不清楚。本研究將為這些化合物提供新的生物來源，同時為粉被蟲草的深度開發利用提供科學參考。

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（責任編輯：丁志祥）