通解口服液對MO D S模型大鼠回腸P P A R-γ、A P-1、N F-κB表達的影響

沈宇清 賈典榮 曹 云 顧志林

（南京中醫藥大學附屬姜堰中醫院，江蘇姜堰225500）

多器官功能障礙綜合征 （multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是目前創傷、感染、休克等疾病最重要的死亡原因，目前醫學界普遍認為胃腸道是MODS發病過程中受累較早的器官，胃腸黏膜缺血炎癥反應是其重要的病理機制之一。近年有研究報道過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）是調節缺血炎癥反應的重要作用靶點，而中藥通過干預炎癥反應的各個環節發揮著胃腸功能的保護作用。本院研發的通解口服液具有通里攻下、活血化瘀等作用，臨床發現其對MODS患者急性胃腸損傷有防治作用[1]。為進一步研究通解口服液防治MODS急性胃腸損傷的機理，本實驗通過建立MODS大鼠模型，觀察通解口服液對MODS模型大鼠回腸組織PPAR-γ、激活蛋白-1（AP-1）、核轉錄因子 κB（NF-κB）表達的影響，探索MODS新的防治途徑。

1 實驗材料

1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠48只，體重（190±20）g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 藥物 通解口服液（處方：大黃、蒲黃、敗醬草、枳實、茜草各等份，藥物濃度0.85g/mL）由泰州市姜堰中醫院藥劑科提供，批號：20130917，250mL/瓶。氨芐西林 （珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司），0.25g/粒，批號：30100304，以蒸餾水配成藥液。兔抗鼠AP-1抗體（aN-20），美國Santa Cruz公司，批號：sc-12629；兔抗鼠NF-κB p65抗體，武漢博士德生物工程有限公司，批號：bs-0465R；兔抗鼠PPAR-γ抗體，武漢博士德生物工程有限公司，批號：bs-0530R；總蛋白試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號：20131117。

1.3 儀器 MP100型16導生理記錄儀及其附件，美國BIOPAC公司；Synergy HT型紫外熒光酶標儀，美國Biotek公司；Olympus光學顯微鏡；瑞典產LKB-V超薄切片機；H-600日立型透射電鏡；S-450型日立掃描電鏡；HH數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠；ALC-MPA2000m型4導生理記錄儀及其附件，上海奧爾科特儀器公司；R-911型全自動放免計數儀，中國藥科大學實業總公司；7160型日本日立全自動生化分析儀。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 SD雄性大鼠隨機分為6組：空白對照組、模型組（生理鹽水 0.018g·kg-1·d-1）、陽性藥物組 （氨芐西林0.4g·kg-1·d-1）和通解口服液低（8.5g·kg-1·d-1）、中 （17g·kg-1·d-1）、高 （34g·kg-1·d-1）劑量組，各組間體重無顯著性差異。預先分別灌胃生理鹽水或藥物，連續給藥2d，每日2次，最后一次灌胃給藥48h后開始禁食不禁水，禁食12h后再灌胃給藥1次后造模。

2.2 造模 給藥后腹腔注射10%水合氯醛（3.0mL/kg）麻醉，舌下靜脈注射脂多糖 （LPS）8mg/kg復制MODS急性胃腸損傷大鼠模型[2]。符合臨床實際的MODS實驗模型應具備的標準是：（1）損傷因素與臨床MODS常見誘因基本一致；（2）發病在致傷24h以后；（3）有 SIRS 的臨床表現；（4）有 2 個以上器官或系統的功能障礙；（5）有足夠的發病率和死亡率。實驗動物MODS的診斷依據與人類基本一致，即：誘因+SIRS+多器官功能障礙[3]。我們實驗中大鼠出現生命體征變化，嚴重肝腎功能損傷，符合MODS診斷[4]。

2.3 指標檢測 免疫組化法對回腸進行PPAR-γ、AP-1、NF-κB蛋白表達檢測，建模6h后，各組大鼠麻醉后予脫頸處死，迅速取出回腸沿系膜緣剖開，去除內容物，PBS液漂洗，取上段回腸置于4%多聚甲醛固定，固定后的組織在PBS中漂洗5min×3次，上行脫水，將組織塊放入二甲苯中5～30min，石蠟包埋，用石蠟切片機切片，厚度為5μm，進行免疫組化染色，顯微鏡下胞漿呈棕黃色顆粒視為陽性表達。每組取8個標本檢測，應用Image-ProPlus6.0分析軟件，每個標本選取肌層區域，計算所選區域的面積（area）和所選區域內免疫組化陽性信號總的灰度值的乘積，最后以每組均值進行比較。

2.4 統計學方法 使用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗。 P＜0.05，P＜0.01為差異有統計學意義。

3 實驗結果

與空白對照組比較，模型組大鼠回腸組織PPAR-γ表達顯著降低（P＜0.01），AP-1 表達顯著升高 （P＜0.01），NF-κB 也表現增加趨勢。與模型組比較，通解口服液低劑量組與陽性藥物組大鼠PPAR-γ的改變不明顯（P＞0.05），通解口服液中、高劑量可顯著增加模型大鼠 PPAR-γ 的表達（P＜0.05，P＜0.01）；各給藥組均可明顯降低 AP-1、NF-κB 的表達（P＜0.05，P＜0.01）。與陽性藥物組比較，通解口服液中、高劑量對于上述指標的改善更具優勢（P＜0.05，P＜0.01）。 通解口服液各劑量組間比較，體現出一定的量效關系。見表1。

空白對照組大鼠回腸組織可見PPAR-γ陽性（呈棕黃色）表達，模型組、陽性藥物組、通解口服液低劑量組大鼠PPAR-γ表達不顯（呈淺黃色），通解口服液中劑量組大鼠PPAR-γ表達明顯 （呈深黃色），高劑量組可見PPAR-γ陽性（呈棕黃色）表達。見圖1。

空白對照組大鼠回腸組織未見AP-1陽性表達，模型組大鼠見AP-1陽性表達（呈棕黃色），陽性藥物組和通解口服液低、中劑量組大鼠AP-1表達不明顯（呈淺黃色），通解口服液高劑量組大鼠回腸組織未見AP-1陽性表達。見圖2。

空白對照組大鼠回腸組織未見NF-κB陽性表達，模型組大鼠見NF-κB陽性表達（呈棕黃色）；陽性藥物組和通解口服液低、中劑量組大鼠NF-κB陽性表達不明顯（呈淺黃色），通解口服液高劑量組大鼠回腸組織未見NF-κB陽性表達。見圖3。

表 1 各組大鼠回腸組織 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表達比較（±s）

表 1 各組大鼠回腸組織 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表達比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與通解口服液低劑量組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

組別 動物數（只）陽性藥物組 8 1.06±0.42** 1.25±0.46*通解口服液低劑量組 8 1.50±0.53* 1.13±0.58*通解口服液中劑量組 8 0.94±0.56**△※ 0.81±0.26**△※劑量（mg/kg）PPAR-γ空白對照組通解口服液高劑量組 8 0.88±0.52**△△※ 0.69±0.26**△△※※- 2.50±0.53**- 1.63±0.52 0.4 1.63±0.74 8.5 1.75±0.71 17 2.25±0.71*△34 2.50±0.53**△△※AP-1 8 NF-κB 0.94±0.18**1.31±0.59模型組82.00±0.53 2.00±0.76

圖1 各組大鼠回腸組織PPAR-γ表達的病理圖片（HE，×400）

4 討論

MODS是指機體遭受嚴重急性損傷后，由于失控的全身炎癥反應，使機體在短時間內（＞24h）同時或序貫出現兩個或兩個以上系統器官功能障礙的臨床綜合征，而醫學界普遍認為胃腸道是促發MODS的始動器官和靶部位。胃腸功能狀態被認為是判斷危重病人預后的一項重要指標。胃腸運動功能的恢復有助于有效阻斷MODS的進一步發展。目前針對MODS胃腸功能損傷尚無特效藥，臨床上主要采用腸內營養、抑酸、改善腸動力等治療，但療效并不理想，因此采用中醫藥干預成為當前研究的熱點。我們既往研究發現，通瘀解毒法有助于改善MODS患者胃腸功能，因此設計本實驗做一次機理探索。

PPAR-γ是一類依賴配體激活的核轉錄因子，參與許多生理反應的調節，其生物學功能復雜多樣，包括調控脂肪和糖代謝、脂肪細胞終末分化、抗肝纖維化作用，減輕細胞氧化應激損傷，保護臟器功能等。近年來研究發現，PPAR-γ及其激動劑在抗缺血再灌注損傷方面起著重要作用，是細胞炎癥及缺血反應的重要調節因子[5]。PPAR-γ被其天然與合成配體激活后，可抑制炎性細胞因子白介素-1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的分泌，抑制黏附因子ICAM-1及P-選擇素、E-選擇素等的表達，同時也能減少誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，從而發揮抑制炎癥反應、改善血管內皮功能的作用。上述炎性因子的表達均依賴于轉錄因子：激活蛋白-1（AP-1）、核轉錄因子 κB（NF-κB）的活性而發揮作用，而活化的PPAR-γ可以抑制二者的活性。臨床研究表明，MODS患者PPAR-γ活性明顯下調[6]。膿毒血癥及腸炎患者體內PPAR-γ表達減少，IL-1、IL-6及 TNF-α 表達水平較高[7-8]，特別是MODS患者。因此上調PPAR-γ的表達在MODS急性胃腸損傷的防治中有重要的意義。

圖2 各組大鼠回腸組織AP-1表達的病理圖片（HE，×400）

圖3 各組大鼠回腸組織NF-κB表達的病理圖片（HE，×400）

我們經過長期臨床觀察，發現MODS起病急驟，病情重篤，發生變證時多有毒，傷血動血敗血甚者必有毒，病情頑固纏綿者常蘊毒，癥見穢濁者則有毒。MODS的臨床特點和病理演變符合中醫學“毒”的特性，而急性胃腸功能損傷則是“熱從毒化，變從毒起，瘀從毒結”的結果之一。我們抓住MODS急性胃腸損傷“毒瘀互結”的病理中心，以“六腑以通為用”之要義，確立了通瘀解毒的治療大法，并研制出通解口服液應用于臨床。通解口服液中大黃、敗醬草解毒通瘀，既能清解熱毒，又能化瘀通腑，共為君藥；配伍枳實、蒲黃、茜草，達到疏與通合，清與散配，化瘀而不動血，止血而不留瘀的效果。既往研究發現通解口服液可改善MODS患者胃腸功能[9]，對MODS大鼠炎癥反應具有明顯的抑制作用[4]。本研究以回腸PPAR-γ、NF-κB和AP-1蛋白的表達為觀察指標，評估通解口服液對PPAR-γ、NF-κB和AP-1調控作用。結果顯示，各劑量的通解口服液均可上調MODS模型大鼠回腸組織PPAR-γ的表達，降低NF-κB和AP-1的表達，且以中、高劑量組改善程度更明顯，認為通解口服液對MODS模型大鼠回腸組織 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表達的影響與其劑量有一定的相關性。通解口服液可能是通過激活抗氧化系統、抗炎、保護血管內皮等作用防治MODS。下一步我們將更深入地研究PPAR-γ、炎癥因子與腸平滑肌細胞之間的相關性，從微觀角度探討通解口服液防治MODS胃腸損傷的作用靶點。

[1] 鄭小丹，沈宇清，曹云，等.通瘀解毒法防治MODS急性胃腸損傷的臨床研究.中醫藥臨床雜志，2014，26（4）：356

[2] 喬萬海，屈莉，師猛，等.MODS大鼠外周血中PPAR-γ與TNF-α和IL-10動態變化的研究.第四軍醫大學學報，2009，30（8）：690

[3] 胡森，盛志勇，周寶桐.MODS動物模型研究進展.中國危重病急救醫學，1999，11（8）：504

[4] 鄭小丹，沈宇清，曹云，等.通瘀口服液對多器官功能障礙綜合征大鼠模型IL-6、TNF-α的影響.上海中醫藥雜志，2015，49（1）：87

[5] Kapadia R，Yi JH，Vemuganti R.Mechanisms of antiinflammatoryand neuroprotective actionsofPPAR-gamma agonists.Front Biosci，2008，13：1813

[6] 湯石林，趙正亮，王橋生，等.膿毒癥大鼠PPAR-γ與脂聯素表達水平的相關性研究.海南醫學，2012，23（3）：317

[7] 黃曉梅，曾勉，盧桂芳，等.膿毒癥大鼠有核細胞PPAR-γ活性變化對TNF-α及IL-4的影響.中山大學學報（醫學科學版），2010，31（5）：630

[8] 吳錢紅，劉喆.過氧化物酶體增殖物激活受體Ⅴ在炎癥過程中調控作用的研究進展.廣西中醫學院學報，2011，14（2）：79

[9] 席峰，曹云，沈宇清.通瘀解毒法“治未病”干預MODS的臨床療效評價.中醫藥臨床雜志，2014，26（12）：1224