脂易消對(duì)NAFLD大鼠Visfatin蛋白表達(dá)的影響*

周岳君 陳玉翠

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，其病理學(xué)改變與酒精性肝病（ALD）相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis， NASH）、及相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-4]。NAFLD是21世紀(jì)全球重要的公共健康問題之一，亦是我國(guó)愈來愈重視的慢性肝病，加強(qiáng)NAFLD的預(yù)防與治療，延緩和阻止NAFLD的發(fā)生、發(fā)展成為當(dāng)前中西醫(yī)研究的熱點(diǎn)[5-6]。

NAFLD的發(fā)病機(jī)理至今尚未十分明確，近年有學(xué)者認(rèn)為脂肪細(xì)胞因子在肝脂肪變性進(jìn)程中可能起著十分重要的作用。其中內(nèi)肥素（Visfatin）因具有類胰島素作用可降低血糖、參與脂肪代謝等生理環(huán)節(jié)而備受關(guān)注[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食喂養(yǎng)制備NAFLD大鼠模型，通過中藥驗(yàn)方脂易消予以干預(yù)，闡明Visfatin與NAFLD發(fā)病的相關(guān)性，探討NAFLD的發(fā)病機(jī)理和中醫(yī)藥治療NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重（180±10）g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫23 ℃，濕度50%，明暗各12 h，隨機(jī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水和采食，預(yù)養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段[9]。

1.2 藥物 脂易消：半夏、枳殼、荷葉、水飛薊、澤瀉、決明子等生藥材購自浙江省杭州市方回春堂國(guó)藥館[10]。易善復(fù)膠囊（多烯磷脂酰膽堿膠囊）：北京萬安特制藥有限公司，228 mg/粒，批號(hào)：D1141。使用前用蒸餾水超聲乳化，配制成1 L含多烯磷脂酰膽堿132.4 g。生理鹽水：浙江莎普愛思藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110313-3。

1.3 器材 GKC可控硅恒溫水浴鍋，上海錦屏儀器儀表有限公司。3000紫外線分光光度儀，Pharmacin公司。TGL68高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安寧科學(xué)儀器廠。OLIMPUS顯微鏡，日本OLYMPUS公司。7170全自動(dòng)生化分析儀，日本AAS公司。Hoefer300電轉(zhuǎn) 儀；IS1000凝 膠 成 像 儀；MyCycler PCR儀；The BioRadiCyclerIq PCR儀；Optical Caps （8 Caps/Strip）（Applied Biosystems； Cat # 4323032）；Optical Adhesive Covers （Applied Biosystems； Cat # 4311971，美國(guó)BioRad公司。WD900TL23-2微波爐，Galanz。ZF-90型暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠。DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠。DNA離心干燥箱，上海安亭科學(xué)儀器廠。Ultrospec3300pro微量核酸測(cè)量?jī)x，Ampersand。冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，Heraeus。可調(diào)微量加樣槍，Thermo Labsystems。-80 ℃低溫冰箱，Sanyo。AR2130電子精密天平OhausCorp.Pine Brook，NJ，USA。YDS-3S液氮生物容器，四川亞西機(jī)器廠[11-12]。

1.4 試劑 TG檢驗(yàn)試劑盒，上海申能-德賽有限公司，批號(hào)：571/017/01；TC檢驗(yàn)試劑盒，上海申能-德賽有限公司，批號(hào)：130/016/01；氯仿（分析純）浙江迪耳藥業(yè)有限公司。異丙醇（分析純），浙江杭州雙林化工試劑廠。瓊脂糖（agarose）溴化乙錠（EB），上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。M-MLV RTase，invitrogen。Taq 酶，Oligod（T）18Primers，RNase inhibitor，dNTP，100 bp marker等。

1.5 方法

1.5.1 造模與分組 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成脂易消低、中、高劑量治療組，易善復(fù)陽性對(duì)照組，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組6組，每組各10只。正常組予普通飼料喂養(yǎng)，其余予高脂飼料喂養(yǎng)（內(nèi)含10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽鹽、5%蛋黃粉，82.5%普通飼料）喂養(yǎng)，造模12周后處死動(dòng)物。

1.5.2 給藥途徑及劑量 脂易消低、中、高劑量治療組干預(yù)劑量分別相當(dāng)于成人每千克體重臨床用量的3、6、12倍，易善復(fù)劑量相當(dāng)于成人每千克體重臨床用量的6倍，均為臨床等效劑量。實(shí)驗(yàn)劑量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究“等效劑量”的計(jì)算方法（50 kg人/200 g大鼠的轉(zhuǎn)換系數(shù)r=0.021）計(jì)算等效脂易消劑量[13]。實(shí)驗(yàn)劑量經(jīng)計(jì)算確定如下：低劑量組，高脂飼料喂養(yǎng)，按等效劑量7.5 g/（kg·d）灌胃，共12周；中劑量組，高脂飼料喂養(yǎng)，按等效劑量15 g/（kg·d）灌胃，共12周；高劑量組，高脂飼料喂養(yǎng)，按等效劑量30 g/（kg·d）灌胃，共12周；易善復(fù)組，高脂飼料喂養(yǎng)，按等效劑量69.2 mg/（kg·d）灌胃，共12周；正常組，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，等容量的生理鹽水灌胃，1次/d，共12周；模型組，高脂飼料喂養(yǎng)，等容量的生理鹽水灌胃，1次/d，共12周。

1.5.3 標(biāo)本采集與保存 實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)至第12周末次給藥后，當(dāng)晚禁食12 h但不禁水，次日上午用10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，心臟取血，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待用；迅速取出肝組織，稱重，在肝右葉中部切取數(shù)塊肝組織保存于液氮中以備用。

1.5.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.4.1 肝組織勻漿TC、TG變化檢測(cè) 將玻璃試管中新鮮肝組織稱重，精密稱定，剪碎后加入9倍冰生理鹽水，用均質(zhì)機(jī)磨成10%肝組織勻漿后，4000 r/min離心10 min，提取上清液，上清液即為肝組織勻漿制品。肝勻漿TC、TG測(cè)定均按試劑盒說明操作。

1.5.4.2 肝組織病理學(xué)檢測(cè) 取大鼠肝臟右葉肝組織，HE染色觀察肝組織炎癥、細(xì)胞變性情況等一般病理改變。非酒精性脂肪性肝炎病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《非酒精性脂肪性肝炎診斷指南》實(shí)施[1]。（1）依據(jù)肝細(xì)胞脂肪變性占據(jù)所獲取肝組織標(biāo)本量的范圍，分為5度（F0~4）：F0：肝細(xì)胞內(nèi)無脂滴沉積；F1：肝小葉內(nèi)<30%的肝細(xì)胞有脂肪變；F2：肝小葉內(nèi)30%~50%的肝細(xì)胞有脂肪變；F3：肝小葉內(nèi)50%~75%的肝細(xì)胞有脂肪變；F4：75%以上的肝細(xì)胞有脂肪變。（2）依據(jù)炎癥程度分為4級(jí)，G0：無炎癥；G1：腺泡3帶呈現(xiàn)少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)散在個(gè)別點(diǎn)灶狀壞死；G2：腺泡3帶明顯氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死增多，門管區(qū)輕-中度炎癥；G3：腺泡3帶廣泛的氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點(diǎn)灶狀壞死明顯，門管區(qū)輕-中度炎癥或門管區(qū)周圍炎癥。

1.5.4.3 ELISA法檢測(cè)Visfatin蛋白表達(dá) 按照試劑盒操作說明進(jìn)行，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出肝組織標(biāo)本中Visfatin蛋白濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用單因素方差分析（one way ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)期間，共有2只大鼠死亡，其中低劑量組1只，高劑量組1只。正常組大鼠精力旺盛，活潑好動(dòng)，飲食正常，毛發(fā)有光澤，糞便成形，體重增加緩慢。模型組大鼠體重較正常組增長(zhǎng)較快，毛發(fā)油膩，糞便松軟粘臭，不成形，實(shí)驗(yàn)初期活動(dòng)尚可，后期大鼠活動(dòng)減少，形體肥胖，動(dòng)作慵懶。脂易消高劑量組、中劑量組、低劑量組及易善復(fù)組大鼠體重增加緩慢，狀態(tài)較模型組好，但不及正常組。

2.1 肝勻漿生化指標(biāo)的測(cè)定 與正常組相比，脂易消各劑量組、易善復(fù)組、模型組大鼠肝組織TC含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，脂易消各劑量組和易善復(fù)組TC水平均有顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與易善復(fù)組相比，脂易消各劑量組肝組織TC水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。大鼠肝組織勻漿TG水平：與正常組相比，脂易消各劑量組、易善復(fù)組TG水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組大鼠肝組織TG含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，脂易消各劑量組和易善復(fù)組TG水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與易善復(fù)組相比，脂易消各劑量組肝組織TG水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組大鼠肝勻漿TC、TG變化（x-±s）

2.2 常規(guī)HE染色光鏡下觀察

2.2.1 正常組 HE染色顯示，大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞多為單核，肝板呈條索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

2.2.2 模型組 HE染色顯示，大鼠肝組織可見彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，存在大量脂肪空泡。匯管區(qū)和小葉間有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，部分大鼠小葉內(nèi)壞死灶融合成片，但未見肝纖維化形成，其肝組織脂肪變性程度與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖 2、表 2。

2.2.3 脂易消各劑量組 HE染色顯示，大鼠肝組織呈彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，可見小泡性、大泡性及氣球樣混合的脂肪變性，程度較模型組略輕，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。匯管區(qū)和小葉間有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其炎癥積分明顯低于模型組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖3~5、表2~3。

2.2.4 易善復(fù)組 基本與脂易消各劑量治療組相近，大鼠肝組織可見彌漫性、混合性肝細(xì)胞脂肪變，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有少量點(diǎn)灶狀壞死。其炎癥積分與脂易消各劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6、表2~3。

圖1 正常大鼠（HE染色×280）

圖2 模型組大鼠 （HE染色×100）

圖3 脂易消低劑量組大鼠（HE染色×100）

圖4 脂易消中劑量組大鼠 （HE染色×100）

圖5 脂易消高劑量組大鼠（HE染色×100）

圖6 易善復(fù)組大鼠 （HE染色×100）

表2 各組大鼠肝脂肪變性程度 只

表3 各組大鼠肝組織炎癥活動(dòng)度 只

2.3 肝組織Visfatin蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 大鼠肝組織Visfatin蛋白表達(dá)情況：低劑量組為（17.31±0.27）ng/L，中 劑 量 組 為（16.85±0.44）ng/L， 高 劑 量 組 為（16.97±0.58）ng/L，易善復(fù)組為（17.19±0.38）ng/L、模型組為（18.52±1.38）ng/L，正常組為（16.02±15）ng/L。與正常組相比，模型組、脂易消低劑量組大鼠肝組織Visfatin蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組相比，脂易消各劑量組及易善復(fù)組大鼠肝組織Visfatin蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與易善復(fù)組相比，脂易消各組大鼠肝組織Visfatin蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。大鼠內(nèi)脂素濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。

圖7 大鼠內(nèi)脂素濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織內(nèi)TG、TC含量均顯著上升，而脂易消各劑量組大鼠肝組織TC、TG含量均較之降低，表明脂易消能抑制肝臟細(xì)胞內(nèi)TC、TG合成，從而改善NAFLD的進(jìn)展。

脂易消能抑制肝臟細(xì)胞內(nèi)TC、TG合成，改善NAFLD的發(fā)病進(jìn)展，能改善肝細(xì)胞炎癥活動(dòng)度，減輕肝組織損傷，顯著降低NAFLD大鼠肝組織Visfatin蛋白表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)提示脂易消治療NAFLD療效確切，其作用機(jī)理可能與Visfatin參與了NAFLD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。脂易消可能通過影響Visfatin的合成和分泌從而改善了NAFLD的生化指標(biāo)。已有實(shí)驗(yàn)證明Visfatin具有類胰島素作用并可以降低血糖、參與脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)，因此進(jìn)一步深入研究Visfatin是通過胰島素信號(hào)通路還是其他信號(hào)通路參與了NAFLD的發(fā)生和發(fā)展具有積極的意義[14-15]。

[1]中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會(huì).非酒精性脂肪性肝病的中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（2）：155-158.

[2]梁冰，陳曦，劉雙燕，等.非酒精性脂肪肝與胰島素抵抗的關(guān)系[J].臨床肝膽病雜志，2006，22（3）：213-214.

[3]高鑫.非酒精性脂肪性肝病與代謝綜合征[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2011，31（9）：664-667.

[4]李瑜元.非酒精性脂肪性肝病的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2013，21（2）：109-115.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)會(huì)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪肝病診療指南（2010年修訂版）[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19（6）：483-487.

[6]范建高.中國(guó)非酒精性脂肪性肝病的流行病學(xué)[J].中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志，2010，33（1）：4-6.

[7] Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M ，et al.Visfatin： a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J].Science，2005，307（5708）：426-430.

[8]羅欣.非酒精性脂肪肝病發(fā)病機(jī)理及診治進(jìn)展[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2013，39（5）：323-325.

[9]南月敏，王蕾，李良霄，等.非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：67-69.

[10]車念聰.非酒精性脂肪性肝病的中醫(yī)證治研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18（5）：257-259.

[11]謝晶日，齊妍.非酒精性脂肪肝病中醫(yī)藥研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（3）：5-7.

[12]程勤，陳來旺.高脂飼料誘發(fā)非酒精性脂肪肝實(shí)驗(yàn)研究[J].淮海醫(yī)藥，2014，32（6）：521-523.

[13]章元沛.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：239.

[14]鄺衛(wèi)紅.肝膽疾病[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2013：200-260.

[15]田春風(fēng)，趙旭紅，梁建英，等.非酒精性脂肪性肝病研究進(jìn)展[J].臨床薈萃，2011，26（12）：1088-1090.