黔產(chǎn)石韋提取物對小鼠外周血白細胞數(shù)的影響

龍 毅，袁吉虎，許楊珊，楊武德

（貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽550002）

石韋為蕨類植物水龍骨科植物石韋〔Pyrrosia lingua（Thunb．）Farwell〕的全草，別名有柄石韋、刀尖藥、石茶葉，其性甘味苦，微寒，歸肺、膀胱經(jīng)，具有清肺泄熱、利水通淋、清熱止血之功效。主要用于淋病、小便不通、出血及肺熱喘咳，屬利水滲濕藥［1］。研究發(fā)現(xiàn)，石韋對因化療及放療引起的白血球減少癥狀有明顯的升白作用［2］。梅志潔等［3］將小鼠隨機分成CTX（環(huán)磷酰胺）組、CTX 加石韋大棗小劑量組、CTX 加石韋大棗中劑量組、CTX 加石韋大棗大劑量組，分別用生理鹽水和石韋大棗合劑不同劑量連續(xù)灌喂，連續(xù)觀察對試驗小鼠白細胞、非特異性免疫功能和粒－單系集落形成單位（CFU－GM）的影響，結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺加石韋大棗合劑大劑量、中劑量組白細胞下降程度明顯低于單純環(huán)磷酰胺組（P＜0．05），石韋大棗合劑能顯著對抗CTX 導致的非特異性免疫功能和粒－單系集落形成單位減少。表明，石韋大棗合劑能明顯增強單核－巨噬細胞系統(tǒng)功能，提高機體免疫能力，對人體無毒副作用，能明顯對抗環(huán)磷酰胺所致的白細胞減少。石韋在貴州應用廣泛，是貴州各民族常用藥，黔產(chǎn)石韋有明顯的地區(qū)特色和藥用價值，研究黔產(chǎn)石韋的升白作用有顯著的經(jīng)濟意義及科學價值。因此，筆者所在研究組進行了有柄石韋的不同極性部位萃取物對小鼠白細胞影響的研究。中藥的水溶液中通常含有氨基酸［4－5］，氨基酸對于人體營養(yǎng)有極其重要的作用，具有調(diào)節(jié)人體生理機能、增強免疫力的功效。谷氨酸在醫(yī)學上主要用于治療肝性昏迷，甘氨酸可用作醫(yī)學微生物和生物化學氨基酸代謝研究的用藥以及金霉素緩沖劑、抗帕金森氏病藥物L－多巴、維生素B6以及蘇氨酸等氨基酸的合成原料。丙氨酸可預防腎結(jié)石、協(xié)助葡萄糖代謝，有助緩和低血糖，改善身體能量。亮氨酸可配制氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑，可作降血糖劑及植物生長促進劑。公認的具有顯著升白效果的中成藥——阿膠中就含高達18 種氨基酸成分［6］。植物氨基酸提高白細胞數(shù)的作用也早有研究證實［7］。筆 者 等 采 用PITC 作 為 衍 生 試 劑［8］，采 用RP－HPLC梯度洗脫法同時對石韋中氨基酸進行分析，以期為黔產(chǎn)石韋提高白細胞數(shù)的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津／lC－20AT），色 譜 柱 為 Welchrom C18 （250 mm×4．6mm，5μm），粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），光學顯微鏡（CKX－41，OLYMPUS）。

1．1．2 藥材 小鼠外周血白細胞數(shù)對比試驗所用藥材采自貴州凱里市雷山縣，鑒定為石韋屬水龍骨科蕨類植物石韋全草。氨基酸成分分析試驗所用石韋藥材粉末購自貴州百靈制藥廠。氨基酸對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100080－200707，包括Leu，Glu，Gly，Ala），PITC（純度標示量為99%），購自貴州銀華科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1．1．3 小白鼠 昆明種，體重18～22g，雌雄各半，清潔級。由貴陽醫(yī)學院提供，合格證號：SCXK（黔）2002－001。

1．2 黔產(chǎn)石韋不同極性部位萃取物的制備

將所有采集的石韋全株陰干后除去雜質(zhì)并粉碎成粗粉備用。

1）醇提物。將有柄石韋的粗粉用75%乙醇提取3次，合并提取液，水浴60℃揮發(fā)，得流浸膏，提物備用。

2）水提物。將藥材醇提后的藥渣陰干，于溫度約70℃熱水中煎煮3 次，合并濾液至蒸發(fā)皿中蒸干，放入干燥箱內(nèi)干燥，備用。

3）石油醚部位。將醇提物流浸膏用溫水（溫度約為40℃）溶解，用石油醚重復萃取至無色即可，合并液，濃縮，置水浴鍋上蒸干，備用。

4）乙酸乙酯部位。將石油醚萃取后的水溶液于水浴鍋上揮發(fā)掉殘余的石油醚后，用乙酸乙酯萃取剩余溶液，合并液，濃縮，干燥備用。

5）正丁醇部位。將乙酸乙酯萃取后的水溶液于水浴鍋上揮發(fā)掉殘余的乙酸乙酯后，用正丁醇萃取，合并液，濃縮，干燥備用。

6）剩余部位。將正丁醇萃取完成后的剩余部位轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上濃縮，待全部水分蒸干后放進干燥箱內(nèi)干燥后備用。

1．3 黔產(chǎn)石韋提取物對小鼠外周血白細胞數(shù)的影響

取小白鼠140只，雌雄各半，隨機分為14組，分別為空白對照組、陽性對照組（灌胃阿膠，3g／kg）和給藥組（分別為醇提物大劑量組、小劑量組，水提物大劑量組、小劑量組，石油醚萃取物大劑量組、小劑量組，乙酸乙酯萃取物大劑量組、小劑量組，正丁醇萃取物大劑量組、小劑量組，剩余部位大劑量組、小劑量組；以上各組劑量分別為7g／kg、2．0g／kg，

7g／kg、2．0g／kg，1．0g／kg、0．3g／kg，0．9g／k、0．3g／kg，1．8 g／kg、0．6 g／kg 和3．3 g／kg、1．1g／kg）。分別對各組小白鼠進行斷尾取血40μL，加入盛有280μL白細胞稀釋液的具塞離心管中，搖均，靜置。取10μL，滴于白細胞計數(shù)板，光學顯微鏡低倍鏡下觀察，記錄計數(shù)板上第二象限和第四象限上的白細胞數(shù)，以兩次計數(shù)的平均值表示小鼠外周血白細胞數(shù)基礎值。取血后第2天開始給藥，空白對照組以0．1mL／10g灌胃生理鹽水，陽性組以0．3g／mL的阿膠混懸液按0．1mL／10g灌胃給藥，給藥組按相應劑量以0．1mL／10g灌胃給藥，連續(xù)10d，每天1次。第11天分別對各組小白鼠進行白細胞測定，方法同上。記錄白細胞數(shù)。

1．4 黔產(chǎn)石韋氨基酸成分分析

1） 色譜條件。色譜柱為 Welchrom C18（250mm×4．6mm，5μm），流動相A 為0．1mol／L的醋酸鈉緩沖液（以醋酸鈉pH6．5）－乙腈（93∶7），流動相B為乙腈－水（4∶1），檢測波長為254nm，柱溫為30℃，流速為1．0mL／min，進樣量為5μL，進行梯度洗脫。

2）對照品溶液的制備及標準曲線的繪制。取4種氨基酸適量，精密稱定，加入0．1mol／L鹽酸溶液制成每1mL分別含谷氨酸（Glu）0．123mg、甘氨酸（Gly）0．079 2 mg、丙氨酸（Ala）0．065 mg、亮氨酸（Leu）0．072mg溶液，即得對照品儲備液。分別吸取氨基酸對照品儲備液1mL、2mL、3mL、5mL和10 mL，分別置25 mL 量瓶中，加入0．1 mol／L PITC－乙腈溶液及1 mol／L 三乙胺－乙腈溶液至刻度，混勻。取溶液10mL，加入正己烷15mL，放置20min，取下層溶液，微孔濾膜（0．45μm）過濾，得系列濃度溶液，按上述色譜條件進樣色譜檢測，測定峰面積。分別以氨基酸對照品峰面積y 為縱坐標，4種氨基酸對照品濃度x（μg／mL）為橫坐標，繪制工作曲線，計算回歸方程。

3）供試品溶液的制備。稱取研勻后樣品粉末0．6g，精密稱定，置安瓿瓶中，加入水解液（含0．5%苯酚的50%鹽酸溶液）10mL，熔封安瓿，用紗布包裹，于150℃水解1h，放冷，過濾，并用水清洗濾渣，合并濾液和洗液于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用0．1mol／L鹽酸溶液15mL 分3次溶解洗滌并轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中，加入0．1mol／L PITC－乙腈溶液［9］及mol／L三乙胺－乙腈溶液各2．5mL，混勻，室溫放置1 h，加50% 乙腈溶液至刻度。取溶液10mL，加入正己烷15mL，放置20 min，取下層溶液，微孔濾膜（0．45μm）過濾即得。

4）樣品含量測定。取供試品溶液5 mL，置于25mL 量瓶中，加入0．1mol／L PITC－乙腈溶液及1mol／L三乙胺－乙腈溶液至刻度，混勻。取溶液10mL，加入正己烷15 mL，放置20 min，取下層溶液，微孔濾膜（0．45μm）過濾所得溶液，按上述色譜條件進樣色譜條件，測定峰面積，對應標準曲線讀取相應濃度。

1．5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同極性部位的萃取率

由表1可知，不同極性部位的萃取率差異不大。其中，萃取后剩余部位的萃取率最高，達4．73%；正丁醇部位其次，為2．51%；石油醚部位和乙酸乙酯部位的萃取率較低，分別為1．53%和1．36。

2．2 不同極性部位萃取物對小鼠外周血白細胞數(shù)的影響

由表2可知，與空白對照組比較，陽性對照組能明顯提高小鼠外周血白細胞數(shù)；水提物大劑量組、小劑量組，醇提物大劑量組、小劑量組，正丁醇大劑量組、小劑量組和剩余部位大劑量組、小劑量組均能明顯提高小鼠外周血白細胞數(shù)。其中，陽性對照組、水提物大劑量組、水提物小劑量組、醇提物大劑量組、正丁醇大劑量組、正丁醇小劑量組和剩余部位大劑量組達0．001顯著水平；醇提物小劑量組和剩余部位小劑量組達0．01顯著水平。石油醚大劑量組、小劑量組、乙酸乙酯大劑量組和小劑量組對小鼠外周血白細胞數(shù)無明顯影響。其中，水提取物的效果最明顯。

表1 黔產(chǎn)石韋不同提取部位的萃取率Table 1 Extraction rate of different parts of P．petiolosa

表2 黔產(chǎn)石韋各極性萃取物給藥后小鼠外周血白細胞數(shù)Table 2 White cell count in peripheral blood of mice injected with extracts with different polarity

表3 黔產(chǎn)石韋中4種氨基酸的含量Table 3 Contents of four kinds of amino acids inP．petiolosa

2．3 黔產(chǎn)石韋氨基酸成分

目前，較少有涉及石韋中氨基酸的成分及含量的研究，本研究表明，黔產(chǎn)石韋中至少含有4種氨基酸，其對應的含量見表3，各種氨基酸含量順序為谷氨酸＞甘氨酸＞丙氨酸＞亮氨酸，這與劉恒霞等在5種蕨類植物中發(fā)現(xiàn)的氨基酸含量順序［10］基本吻合。這4種氨基酸中，谷氨酸的含量最高，因此可以推測，谷氨酸是黔產(chǎn)石韋水提取物提高小鼠外周血白細胞數(shù)的關(guān)鍵成分。但與劉恒霞等在其他蕨類植物中的發(fā)現(xiàn)不同，黔產(chǎn)石韋中的甘氨酸含量幾乎是丙氨酸或亮氨酸含量的兩倍。這一特殊現(xiàn)象說明，甘氨酸很可能對提高小鼠外周血白細胞數(shù)起協(xié)同作用。

3 結(jié)論與討論

本研究采用溶劑法提取了黔產(chǎn)石韋的不同極性化學部位，并通過常規(guī)白細胞計數(shù)法評價了不同極性化學部位對小鼠外周血白細胞數(shù)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)石韋水提部位、醇提部位、正丁醇部位、剩余部位這些極性較大部位均對小鼠外周血白細胞數(shù)有明顯升高作用，而石油醚、乙酸乙酯部位這兩個極性較小部位沒有明顯升白效果，其中，水提組分升白效果最為顯著。參考過去的研究工作，氨基酸組分被猜測為水提部位中主要起升白效果的成分，因此本研究組嘗試應用標準品對照的HPLC 方法定量分析黔產(chǎn)石韋中氨基酸成分組成及含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)石韋中至少含有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸4種氨基酸。4 種氨基酸的相對標準偏差均小于3．0%。其中以谷氨酸含量最高。

居霞筠研究組的工作顯示［11］，谷氨酸的鋰鹽具有明顯的升高小鼠外周血中白細胞數(shù)量的作用，除了鋰離子的升白作用外，很可能谷氨酸根離子也參與了作用。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，推測谷氨酸是黔產(chǎn)石韋水提取物中起到升白效果的關(guān)鍵成分。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，甘氨酸含量幾乎是丙氨酸或亮氨酸含量的兩倍，這與過去在其他的蕨類植物中發(fā)現(xiàn)的3種氨基酸含量接近的結(jié)果有明顯區(qū)別。過去的研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸具有細胞保護的作用［12］。在黔產(chǎn)石韋的升白過程中，很可能谷氨酸和甘氨酸均有參與。谷氨酸刺激新的白細胞生成，而甘氨酸則保護已有的白細胞不被機體或外來物質(zhì)破壞而發(fā)生凋亡，即黔產(chǎn)石韋的升白效果是谷氨酸和甘氨酸2種氨基酸的協(xié)同作用。

與過去的研究相比，本研究明確了黔產(chǎn)有柄石韋的各極性組分升白效果的區(qū)別，推測藥物分子極性很可能會影響藥材的升白效果，并且詳細研究了黔產(chǎn)石韋的氨基酸成分，推斷了谷氨酸對于黔產(chǎn)石韋升白效果的關(guān)鍵作用。對黔產(chǎn)石韋升白效果的進一步研究提供了理論依據(jù)。

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