合浦珠母貝基因組微衛星富集文庫的構建與分析

油九菊 , 范嗣剛 黃桂菊 郝博飛 , 陳飛飛 , 喻達輝

(1.農業部南海漁業資源開發與利用重點實驗室, 南海生物資源與開發利用協同創新中心, 中國水產科學研究院 南海水產研究所, 廣東 廣州 510300; 2.上海海洋大學 水產與生命學院, 上海 201306)

合浦珠母貝(Pinctada fucata), 又名馬氏珠母貝(Pinctada martensiiDunker), 隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、珍珠貝科(Pteriidae)、珠母貝屬(Pinctada)[1], 主要分布在中國的廣東、廣西、海南和臺灣沿海[2], 是目前我國用于培育海水珍珠的主要貝種之一。合浦珠母貝所產珍珠即為歷史上聞名遐邇的南珠, 是名貴裝飾品, 在國際上久負盛名。同時,合浦珠母貝肉鮮美可食, 貝殼可加工成珍珠粉, 入藥治病。因此, 合浦珠母貝具有重要的經濟價值。

中國海水珍珠養殖基地主要集中在廣東、廣西、海南三省區沿海地帶, 并成為其經濟發展的支柱性產業之一, 為這些地區的經濟發展和國家的出口創匯作出了巨大貢獻[3]。然而, 由于在過去數十年的珍珠貝生產中, 大量使用近緣養殖貝作為父母本進行貝苗的培育, 導致了馬氏珠母貝的種質急劇退化,養殖性能下降, 養殖成活率低, 個體變小, 育珠質量下降等的問題[3-4]。開展合浦珠母貝的良種選育工作,培育優良的育珠貝品系, 是科研人員當前的重要任務。

微衛星(microsatellite)又稱為簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR), 是以1～6bp的短核苷酸為基本單位, 如(AC)n、(AT)n、(CAG)n、(AGCT)n等, 首尾相連組成的串聯重復序列[5]。微衛星標記具有數量多、分布廣、共顯性遺傳、多態性豐富、結果穩定等優點, 已被廣泛用于動植物的種群鑒定、選擇育種、遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜的構建等方面[6-8]。

迄今, 有關合浦珠母貝微衛星序列的報道并不多, 得到的微衛星標記也很有限[9-12]。本研究擬采用磁珠富集法構建合浦珠母貝微衛星文庫, 分離和篩選合浦珠母貝微衛星標記, 為合浦珠母貝的遺傳選育、群體遺傳學研究和遺傳圖譜的構建提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

用于基因組微衛星文庫構建的合浦珠母貝閉殼肌組織于2008年12月份采自海南三亞, 2011年3月份取合浦珠母貝三亞養殖群體閉殼肌組織, 用于多態性引物的篩選。樣品均于95%酒精保存。按照《分子克隆實驗指南》[13]中的方法提取基因組DNA。提取的基因組 DNA 樣品用 1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色檢測, 并測定 OD260和 OD280, 檢測 DNA 的質量和計算濃度, 配成50 ng/μL的DNA備用。

1.2 酶切獲得目的片段

用限制性內切酶MseⅠ于 37℃烘箱酶切基因組DNA 4 h, 酶切體系 30 μL, 包括 3 μL10×NEB Buffer2, 0.3 μL 100×BSA, 1 μLMseⅠ(10U/μL), 4 μL 50ng/μL基因組DNA, 滅菌雙蒸水補足。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

1.3 接頭連接與PCR擴增

用單鏈寡核苷酸合成雙連接頭, 每種寡核苷酸的濃度為 100 μmol/L。MseⅠ接頭序列為 Olig A:5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′, Olig B: 5′-TACTCA GGACTCAT- 3′。95℃變性10 min, 經4 h緩慢冷卻至 10℃, 最終形成雙鏈接頭。將酶切產物與雙鏈接頭于 16℃連接過夜, 連接體系如下: 10×T4 DNA ligase Buffer (ATP+) 3 μL, 100 μmol/L 接頭 3 μL, 上述酶切片段 20 μL, 400 U/μL 的 T4 DNA ligase 0.5 μL,滅菌雙蒸水補足 30 μL。連接產物用簡并引物MseⅠ-N [5′-GAT GAG TCC TGA GTA A(N)-3′] (N 代表堿基A、G、C、T)進行25 μL體系的PCR預擴增,包括 10×PCR buffer 2.5 μL, 10 mmol/L dNTPs 0.5 μL, 10 mmol/LMseⅠ-N 1 μL, 1 U Taq 酶, 酶切連接產物2 μL, 滅菌雙蒸水補足體系。PCR程序為: 95℃變性30 s, 58℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共20個循環; 之后72℃延伸10 min, 4℃。1%瓊脂糖電泳檢測預擴增效果并擴大體系。去除多余的引物、dNTPs等, 將PCR產物濃縮至30 μL。

1.4 雜交并磁珠富集微衛星序列

1.4.1 雜交

100 μL雜交體系包括0.8 μL SSR 探針A(100 μmol/L)[為生物素標記的(AC)15寡核苷酸: 5′bio-(AC)153′],21 μL 20×SSC, 0.7 μL 10% SDS, PCR 回收產物 3 μL,滅菌雙蒸水補足。混勻后95℃變性10 min, 迅速降至58℃, 溫育20 min, 然后取出自然冷卻到室溫。

1.4.2 雜交期間磁珠的準備

取 300 μL 充分搖勻的 Streptavidin MagneSphere?鏈霉素親和素順磁顆粒(Promega)溶液于1.5 mL離心管中, 1 mL TEN100(10 mmol/L Tris-Cl,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.5)混勻清洗磁珠3～5 min, 于架上1 min, 棄上清, 重復2次, 40 μL TEN100懸浮磁珠。

1.4.3 親和捕捉

雜交混合液與磁珠懸浮液混合, 加入 300 μL TEN100混勻。室溫放置30 min得吸附混合液(其間輕柔混合磁珠)。將吸附混合液于磁架上靜置1 min,棄上清, 400 μL松弛性洗滌液TEN1000(10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA, 1000 mmol/L NaCl, pH 7.5)洗滌5 min, 重復2次。400 μL嚴謹性洗滌液(0.2×SSC,0.1% SDS)洗滌5 min, 重復2次。洗滌后的磁珠懸浮于50 μL TE緩沖液中, 95℃變性5 min。磁架上迅速分離上清, 保存為洗脫液①。再向磁珠中加入12 μL NaOH(0.15 mol/L)混勻室溫置 20 min, 分離的上清中加入1.8 μL HCl(1 mol/L), TE緩沖液補足50 μL體積, 保存為洗脫液②。核酸共沉劑沉淀回收兩次的洗脫產物, 溶于20 μL滅菌雙蒸水中, 即得到富含微衛星序列的單鏈短基因組DNA片段。以此片段為模板,MseI primer為引物, PCR體系及條件同1.3連接產物的擴增, 獲得富含微衛星DNA的雙鏈短基因組DNA片段, 檢測富集效果。富集效果好的樣品用DNA Gel Extraction Kit(AXYGEN)切膠回收純化PCR產物, 濃縮至20 μL。1%瓊脂糖電泳檢測回收效果并定量。

1.5 連接T-載體、克隆

連接反應采用TaKaRa的pMD18-T試劑盒, 連接體系為 10 μL: Ligation Solution I 5 μL, PMD18-T Vector 0.5 μL, DNA 1 μL, DNA 片段 3 μL, 滅菌雙蒸水補足。16℃連接 4 h。用E.coliCompetent CellsDH5?(TaKaRa)進行轉化, 得到基因組微衛星文庫。

1.6 文庫篩選、測序、序列特征分析與引物設計

挑選單克隆, 接種到含有氨芐抗生素的LB培養基中, 37℃振蕩培養2 h, 菌液用載體PMD18-T的通用引物 M13-47[5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG AC-3′]、M13-48[5′-AGCGGATAACAATTTCACACA GGA-3′]和 寡 核 苷 酸 序 列 SSRm[5′-CACACACAC ACACACACACACAD-3′]進行PCR篩選鑒定陽性克隆, 并送到上海生工生物工程有限公司進行測序。

用 Chromas軟件分析測序結果, 去掉載體序列和接頭序列。用SSRHunter軟件進行微衛星DNA序列查找: 6或6個拷貝以上的2堿基重復序列, 4或4個拷貝以上的3堿基重復序列, 3或3個拷貝以上的4堿基重復序列, 2或2個拷貝以上的6堿基重復序列。獲得的微衛星序列根據Weber[14]提出的測序標準,對其核心序列進行類型劃分。用Primer Premier 5.0軟件對所得的微衛星序列設計引物并進行 PCR 擴增。PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 合浦珠母貝微衛星文庫的構建

MseⅠ酶切片段主要集中在 200～1000 bp, 表明合浦珠母貝基因組DNA酶切結果理想, 經過PCR擴增、雜交、富集, 得到的洗脫液 PCR擴增產物純化結果見圖1, 利用此富集產物構建合浦珠母貝基因組微衛星文庫。

圖1 PCR產物純化結果Fig.1 The purified PCR products

2.2 克隆與測序結果

本研究共獲得微衛星文庫約2100個菌落。產生兩條或兩條以上擴增帶的插入片段可以推測為含有微衛星序列的陽性克隆。通過 PCR篩選, 得到候選克隆483個(圖2)。對其中135個克隆進行測序, 測序結果分析發現有 122個克隆含有重復次數大于或等于3的微衛星序列( 90.37%)。圖3為測序得到的合浦珠母貝基因組中一段微衛星特征的(AC)n重復序列。

圖2 陽性克隆篩選Fig.2 Screening of positive clones

圖3 合浦珠母貝基因組中微衛星特征的(AC)n重復序列Fig.3 Typical (AC)n repeat sequence in Pinctada fucata genomic microsatellite

2.3 微衛星序列分析

根據 Weber[14]提出的測序標準, 合浦珠母貝微衛星序列中完美型70個, 占82.36%; 非完美型6個,占7.59%; 復合型8個, 占9.41%。

合浦珠母貝微衛星序列最大重復次數為 73次,平均重復次數為7.83次, 其中, 重復6～10次的最多,占 57.75%, 其次為重復 2～5次(11.26%), 11～15次(15.49%), 16～20 次(9.86%), 詳見圖4。

圖4 合浦珠母貝微衛星核心序列重復次數分布頻率Fig.4 The distribution frequency of the microsatellite corerepetition sequence in Pinctada fucata

2.4 引物設計

利用引物設計軟件Primer Premier 5.0對所得的85個微衛星序列進行引物設計, 除去一些側翼序列較短不能設計引物外, 共設計 64對引物(75.29%)。通過優化 PCR 反應條件(如退火溫度, Mg2+濃度),本實驗最終獲得 11對能穩定有效擴增的合浦珠母貝微衛星多態性引物, 見表1。圖5為合浦珠母貝三亞群體在位點PY008(產物片段長度160 bp)的擴增譜帶。

圖5 合浦珠母貝群體在PY008位點的擴增譜帶Fig.5 PCR products amplified from Pinctada fucata population at locus PY008

表1 合浦珠母貝微衛星分子標記及其引物Tab.1 Microsatellite loci and their primers in Pinctada fucata

3 討論

由于通過經典的小片段DNA克隆法構建和篩選部分基因組文庫分離獲得的微衛星序列比例很低[15],因此對于大多數研究而言, 尋找一種高效簡單的分離方法就成了研究的目標。磁珠富集法是一種快速、高效的分離微衛星分子標記的方法, 自提出后被迅速廣泛地應用于動植物的微衛星位點篩選[16-17]。該方法所需時間較短, 獲得的微衛星重復序列的比例高[15]。姬長虹等[18]使用磁珠富集法篩選銀鯽的微衛星, 陽性克隆為 95.3%, 李小寧等[9]用磁珠富集法篩選合浦珠母貝的微衛星, 陽性克隆為 88.5%, 柳明等[19]利用磁珠富集法進行了大珠母貝微衛星的篩選, 報道的為70.81%, 曲妮妮等[10]用FIASCO法篩選合浦珠母貝的微衛星, 陽性克隆為 83.2%, 匡剛橋等[20]FIASCO法篩選鱖魚微衛星標記, 陽性克隆為60%。本研究采用磁珠富集法篩選合浦珠母貝的微衛星序列, 在所測135個克隆中有122個含有微衛星序列,陽性克隆率高達 90.37%, 說明磁珠富集法在貝類中也是一種高效快速的微衛星標記分離方法, 可以應用到其他雙殼貝類微衛星的分離研究。

與其他水產動物相比, 貝類多態位點的篩選效率相對較低, 需要設計大量的引物才能獲得為數不多的多態標記[9-10,21-23]。本研究合成的 65對合浦珠母貝微衛星引物中有20對可以有效擴增, 僅11對具有多態性, 多態性微衛星比例僅有 16.92%。曲妮妮等[10]在篩選合浦珠母貝微衛星標記的研究中, 合成了49對引物只有9對具有多態性, 多態性微衛星比例僅有18.36%。柳明等[19]對大珠母貝微衛星的研究中, 合成的30對引物中僅有10對擴增出具有多態性的目的條帶, 多態性微衛星比例僅有 33.33%。所得到有多態性微衛星的比例都很低, 原因可能與貝類個體之間的遺傳變異程度較大有關[10,19]。Arias等[24]對扇貝的SNPs檢測, 發現大約100個堿基就出現1次 SNP。Sauvage等[25]對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)的研究, 發現在編碼區平均每60 bp出現1次SNPs, 在非編碼區每40 bp就出現1次SNPs。這些高頻率的點突變為微衛星引物的擴增篩選帶來了很大困難。

研究表明, 微衛星廣泛散在于真核生物基因組中, 特別是二核苷酸微衛星重復(AC/TG)n(n大約為10～60)[26]在基因組中的含量十分豐富。本研究采用(AC)n探針, 獲得了85個微衛星序列, 其中(AC/GT)n微衛星引物有64對, 占75.29%。除了大量的雙堿基序列(AC、AT、AG)外, 還有其它單堿基(A、C)、三堿基(ACA、ACG、AGG、AAC)、四堿基(AAAC、CTCT)和四堿基以上(ATTTG、AAAAC、ATTGGG、CGTCCG)的微衛星序列, 因此可以考慮采用其他類型的探針, 如(AG)12、(ACA)15、(GATA)8、(GATT)7[9]研究開發合浦珠母貝基因組微衛星, 以便獲得更多的微衛星分子標記。

多數學者認為微衛星重復次數與多態性之間存在正相關。Valdes[27]認為重復次數低于5的微衛星幾乎檢測不出多態性。一般微衛星的核心序列重復次數越高, 其等位基因數也就越多, 即多態性也就越高[28]。Ellegren[29]認為真核生物中微衛星重復堿基重復序列長度大多在30次重復以下。本研究所得序列重復次數在5～20次的占95.74%, 因此理論上講, 本研究所得引物可用于合浦珠母貝遺傳多樣性分析。

另外, 與哲羅魚[12]、中國對蝦[30]、劍尾魚[31]、長牡蠣[17]、鯉[15]相比, 合浦珠母貝微衛星序列中完美型比例最高, 為 82.36%, 而合浦珠母貝微衛星非完美型比例僅為 7.59%, 僅比中國對蝦的(7.00%)高(表2)。目前為止, 關于微衛星優勢類型的種間差異現象報道較少, 孫效文等認為可能與生物的進化及環境的變遷有關[12]。筆者分析, 可能原因是合浦珠母貝是長期以足絲管附著生活的貝類, 生態環境相比遷徙或浮游生活的水生動物較穩定, 較少有基因組復制過程中的變異。而李琪等[17]報道的固著生活的長牡蠣完美型所占比例并無明顯優勢, 與本實驗所得結論不同。

表2 不同類型的微衛星在水產動物中的分布Tab.2 Distribution of different types of microsatellites in aquatic animals

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