甲殼動物RNAi技術研究與應用進展

邱錫爾 朱冬發 周彥琦 柳志業 謝熙

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

甲殼動物RNAi技術研究與應用進展

邱錫爾 朱冬發 周彥琦 柳志業 謝熙

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的一種使特定基因沉默的現象。作為一種研究基因功能、發現新基因和抗病毒的新型手段，近年來RNAi技術在昆蟲、真菌、植物和哺乳動物等的研究中已被廣泛應用，但是在甲殼動物研究中尚處于起步階段。對甲殼動物RNAi技術實施方法做了簡要介紹；著重綜述了RNAi技術在甲殼動物CHH家族神經肽類基因功能、蛻皮和生長調控機制、配子及性腺發育調控和甲殼動物抗病毒機制研究上的應用進展。

RNAi；甲殼動物；基因功能；抗病毒

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由內源或外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發轉錄后相應mRNA水平下降，是一種轉錄后基因沉默機制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［1］。自Fire等［2］在1998年提出RNAi概念，并在2006獲得諾貝爾獎至今，RNAi技術已成為一種研究基因功能、調控機制、發現新基因、抗病毒和傳染病治療的有效新方法，在昆蟲、真菌、植物、哺乳動物等生物中獲得廣泛應用［3-5］。

蝦蟹類等甲殼動物具有很高的經濟價值，研究其功能基因的調控機制和抗病毒機制等對于開發甲殼動物資源具有深遠意義，但是直到2005年才有文獻描述RNAi技術在甲殼動物研究上的應用［6，7］。本文對甲殼動物RNAi技術實施方法做簡要介紹，并著重綜述RNAi技術在甲殼動物CHH家族神經肽類基因功能、蛻皮和生長調控機制、配子及性腺發育調控和甲殼動物抗病毒機制研究上的應用進展。

1 甲殼動物RNAi的實施方法

1.1 注射法

注射法是實驗室研究甲殼動物RNAi最常用技術，一般將dsRNA或siRNA直接注射到甲殼動物血淋巴、肌肉（局部組織）或卵粒中，使dsRNA或siRNA迅速到達靶組織，該方法干擾效率最高［8］。目前制備dsRNA 的方法主要有體外轉錄和載體構建表達。體外轉錄法用RNA聚合酶轉錄合成單鏈的RNA，再互補成dsRNA；體內載體表達通過構建質粒，在細菌內表達獲得大量dsRNA［8，9］。siRNA 的設計和篩選較dsRNA較為繁瑣，目前合成siRNA 的方法包括體外轉錄、Dicer 酶切割、PCR 擴增和質?；虿《颈磉_siRNA等［10］。已證明注射siRNA也能有效引起基因沉默。例如，給斑節對蝦（Penaeus monodon）和日本囊對蝦（Marsupenaeus Japonicus）注射siRNA均能夠引發抗白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）作用［10，11］。

1.2 離體培養法

由于甲殼動物缺乏研究用的細胞系或細胞株，一般直接采用動物組織與雙鏈RNA進行離體培養。例如，研究者解剖獲取活體斑節對蝦的眼柄神經節（剪碎成0.8-1 cm），在M199培養液中加入100 μg/mL青霉素，于24孔培養板在20-24℃條件下震蕩培養3 h和6 h，每孔加入1.5 mL 培養液。同一只對蝦左側眼柄用于陰性對照，與非特異性綠色熒光蛋白雙鏈RNA（dsGFP）共同培養作為對照組；右側眼柄分別與3 μg GIH dsRNA共同培養作為實驗組。半定量結果顯示實驗組GIH表達量下降［12］。

1.3 飼喂法

昆蟲RNAi試驗多用飼喂法［13］，而甲殼動物受生活環境所限制，飼喂法基因沉默的效率遠低于注射法。但是注射法耗時耗力，對試驗動物造成一定傷害；且單次注射的dsRNA 數量有限。若能解決飼喂手段誘導RNAi效率不高的問題，有希望應用于大型商業養殖中，實現甲殼動物生長發育的人工調控和抗病毒防治。Treerattrakool等［14］通過制備能夠高效表達GIH dsRNA的大腸桿菌E. coli，以成體豐年蟲為中間載體喂食給斑節對蝦，但RNAi效果明顯不如注射法，有待進一步完善。

2 甲殼動物RNAi技術的應用

2.1 CHH家族神經肽基因功能的研究

甲殼動物眼柄中的X-器竇腺復合體（X-organsinus gland，XO-SG）合成并分泌甲殼動物高血糖激素家族（crustacean hyplyeemic hormone family，CHH家族）激素，包括高血糖激素（crustacean hyperglyeemie hormone，CHH）、蛻皮抑制激素（molt-inhibiting hormone，MIH）、性腺抑制激素（gonad/vitellogenesis-inhibiting hormone，GIH/VIH）等肽類激素，這些激素統稱為CHH家族神經肽，調控甲殼動物糖類代謝、蛻皮、繁殖等生理生化過程［15，16］。

2.1.1 高血糖激素CHH CHH肽類激素主要功能是調控甲殼動物體內的血糖水平，維持能量供應［17］。2006年，Lugo等［18］將CHH dsRNA注射到南方濱對蝦（Litopenaeus schmitti）的腹部血淋巴，結果發現在24 h 內CHH表達和相應血淋巴中的血糖濃度均下降，驗證了CHH具有使血糖升高的功能，也說明RNAi技術在甲殼動物上應用的可行性。

2.1.2 蛻皮抑制激素MIH 甲殼動物的蛻皮過程主要由MIH與Y器分泌的蛻皮激素通過拮抗作用來調節［19］。Tiu等［20］以雌性刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）為研究對象，注射MeMIH-B dsRNA后發現胸腺神經節和眼柄組織中的MeMIH表達水平下降，且肝胰腺和卵巢組織中卵黃蛋白（vitellogenin，Vg）基因的表達也隨之下降，證明MeMIH除了抑制蛻皮外，很可能還具有促進性腺發育的功能。向紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）注射MIH dsRNA可以促進其蛻皮的發生［21］。這些研究結果驗證了MIH激素是調控甲殼動物蛻皮的關鍵因子，還很有可能參與卵巢發育的調控。

2.1.3 性腺抑制激素GIH/VIH GIH/VIH是調控甲殼動物性腺發育的主要激素［22］。Treerattrakool等［12］在2008年將GIH dsRNA與斑節對蝦組織進行離體培養試驗后發現，雌性對蝦眼柄和腹部神經節組織中GIH表達水平降低；將GIH dsRNA注射雌性對蝦體內，結果顯示卵巢中的Vg表達水平顯著上升，說明GIH對Vg具有明顯的抑制作用。切除眼柄可以促進克氏原螯蝦（P. clarkii）和日本囊對蝦等多種甲殼動物的親本卵巢成熟［23，24］，Treerattrakool等［25］在2011年的研究進一步說明RNAi技術可以替代傳統的單側眼柄切除，有效抑制GIH表達，從而促進卵巢成熟和排卵。隨后，Treerattrakool等［14］嘗試利用飼喂法替代dsRNA注射法，結果顯示GIH表達水平有明顯下降，但是與注射法結果相比，誘導基因沉默的效果仍有較大差距。以上研究結果表明GIH激素很有可能是通過抑制卵黃蛋白原Vg的生成來調節甲殼動物性腺發育。

2.2 甲殼動物蛻皮和生長調控機制的研究

維甲酸類X受體（retinoid X receptor，RXR）已證明與甲殼動物蛻皮、代謝調節、附肢再生等多種生理生化過程相關［26，27］。RXR通過與蛻皮激素受體（ecdysone receptor，EcR）形成二聚體復合物EcR /RXR，再與蛻皮激素應答元件結合，調控下游基因E75等轉錄，從而調節相關生理過程［28］；也有研究顯示RXR可能是甲殼動物激素MF的受體［29］。

Priya等［30］向中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）體內注射RXR dsRNA，干擾效應在48 h達到高峰，且RXR調控的下游基因FcE75和兩種幾丁質酶（chitinase）基因FcChi和FcChi-1表達水平均顯著下降。研究已證明，甲殼動物幾丁質酶能夠降解外骨骼中的幾丁質，其水解產物會重新進入到新表皮的合成中，且幾丁質酶受到蛻皮激素調控，與蛻皮密切相關［31］。說明RXR參與了甲殼動物的蛻皮激素信號通路、調控下游基因E75和幾丁質酶基因的轉錄表達［31，32］。隨后Priya等［33］為進一步研究E75的功能，通過持續注射FcE75 dsRNA誘導E75沉默，阻礙中國對蝦蛻皮的發生并最終導致試驗對象死亡，結果說明E75很可能與蛻皮調控密切相關且是中國對蝦生長所必須的基因。

甲基法尼酯（methyl farnesoate，MF）是一種類倍半萜烯激素，是甲殼動物體內一種重要的內分泌調控激素，與生長繁育、形態建成、蛻皮、滲透壓調節等多種生理過程有關［34-37］。FAMeT是MF合成路線中最后階段的關鍵酶，Hui等［38］為研究FAMeT的功能，向凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）注射LvFAMeT dsRNA，檢測到眼柄中FAMeT表達水平明顯下降，與蛻皮有關的組織蛋白酶-L（cathepsin-L，LvCat-L）和血藍蛋白（hemocyanin，LvHemo）表達受到影響，試驗對象蛻皮失敗并最終死亡。研究者推測FAMeT在MF合成中具有不可替代的作用，LvFAMeT的沉默使MF合成受到阻礙，從而導致實驗對象的生理調控無法正常進行。該研究結果顯示FAMeT在凡納濱對蝦的蛻皮調控和生長發育中起到了重要作用。

已有報道RXR與甲殼動物附肢再生有關［26，27］。Das等［39］先后切除招潮蟹（Uca pugilator）眼柄和三條步行足、大螯，等待其完全自切殘肢后，在大螯和第三步行足基部早期附肢芽膜內注射EcR dsRNA和RXR dsRNA混合物。結果顯示，招潮蟹再生附肢的生長速度和形態均受到明顯影響，EcR與RXR表達水平顯著下降。通過顯微鏡切片觀察發現，試驗對象再生附肢的表皮生長不良；細胞增殖試驗發現這些再生失敗的附肢芽中幾乎不存在分裂細胞；且蛻皮酮類激素水平下降，未注射部位附肢也無法正常再生，說明該RNAi實驗并不單是在局部起作用，而是能夠引發系統性基因沉默（systemic gene silencing）。長期觀察發現實驗對象多數蛻皮失敗或死亡，說明RNAi實驗對生物體具長期影響。

2.3 甲殼動物配子發生和性腺發育調控機制研究

甲殼動物的促雄腺（androgenic gland，AG），又稱造雄腺、促雄性腺，只存在于雄性個體中，其功能與甲殼動物性腺發育和性別分化有密切關系［40］。研究證明，破壞AG對中國對蝦雄性第二特征發育產生抑制作用，影響交接器生長；切除和移植AG能誘導多種甲殼動物性反轉的發生［41-43］。Rosen等［44］發現促雄腺特異性類胰島素（AG specific insulin-like，IAG）基因在紅螯螯蝦的促雄腺 cDNA消減文庫中具高效表達，說明可能與AG的特殊生理功能有關。研究者注射IAG dsRNA來研究該基因的功能［45］，雄性試驗幼體出現雌性性征，精子數量減少，精巢開始退化；促雄腺細胞過度膨大，可能是體內雄性激素水平低下的反饋作用所導致。說明IAG與紅螯螯蝦雄激素生成有關，其性腺的發育可能依賴于該類基因的調控。馬文明等［46］發現注射促雄腺提取物會抑制雌性羅氏沼蝦卵巢發育，顯微觀察無卵母細胞；將促雄腺激素類似物的dsRNA通過心臟注射到性腺發育成熟雄性個體后，檢測到壺腹中MAL表達量顯著下降，但是對實驗體表型未產生明顯的影響，推測RNAi不容易使性腺發育成熟的沼蝦發生第二性征退化或性反轉。

Kazal型蛋白酶抑制劑（KPI）屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，MRPINK是一種具有兩個Kazal型結構域的蛋白酶抑制劑。在羅氏沼蝦中MRPINK可以特異性地抑制精子明膠酶（MSG）的活性，然而MSG在羅氏沼蝦生殖過程中的生理功能尚不明確。錢葉青等［47］利用RNAi技術進一步研究MSG在受精過程中的功能，將MSG dsRNA注射到成熟雄性羅氏沼蝦體內。結果表明，發生MSG沉默的羅氏沼蝦精子在形態上未異常，但是精子的明膠水解活性下降，與對照組相比無法形成降解圈，說明經RNAi后的精子在體外存在一定的功能缺陷。隨后發現試驗雄蝦與正常雌蝦交配受精能正常進行，推測MSG在精子的蛋白水解活性方面存在重要作用，且雌蝦可能會分泌某些物質來彌補MSG功能缺失。

卵黃磷蛋白是一種高密度糖脂蛋白，是所有卵生動物卵黃的主要成分及胚胎和幼體早期發育主要的營養來源。卵黃蛋白原（vitellogenin，Vg）是卵黃蛋白的前體。卵黃蛋白原的合成和積累對于雌性個體卵母細胞的發育和卵子的數量和質量密切相關，但是Vg的合成部位尚存在爭議。據現有研究顯示，甲殼動物的Vg合成分為內源性和外源性兩種，外源性合成是指卵黃蛋白在卵母細胞以外的部位合成后通過血淋巴運輸到卵巢［48，49］。Tiu等［50］以斑節對蝦為研究對象注射VgR dsRNA來沉默卵黃蛋白原受體（vitellogenin receptor，VgR）基因，檢測結果發現雌蝦卵巢中VgR蛋白含量減少，相反在血淋巴中Vg水平上升。所以該項研究結果說明斑節對蝦的Vg合成很可能通過外源性而來，其VgR很可能是游離存在于血淋巴中，與肝胰腺等部位合成的卵黃蛋白結合后運輸到卵巢中的卵母細胞內。

RXR在脊椎動物的繁殖過程中起到重要作用［51］，但是 RXR在甲殼動物繁殖中的具體功能尚不明確。Nagaraju等［52］發現在普通濱蟹（Carcinus maenas）的卵黃發育不同階段，肝胰腺中RXR表達水平有顯著上升，卵巢中RXR表達水平只在第三階段略有上升，說明RXR與卵巢發育有關。離體培養結果顯示在與MF共同培養的肝胰腺和卵巢組織中，RXR和Vg表達水平比對照組顯著上升。體內注射RXR dsRNA后，RXR和Vg表達水平均下降，血淋巴中MF含量也隨之下降。以上結果說明普通濱蟹RXR可能直接參與或與MF共同調控卵巢發育過程。

2.4 甲殼動物抗病毒機制的研究

已證實RNAi在線蟲、果蠅、蚊和植物等生物中是一種天然的抗病毒機制［5，13］，所以在甲殼動物中RNAi很可能是一種對抗病毒的新型技術手段。RNAi技術通過干擾特定的病毒基因，阻礙病毒復制，提高實驗對象存活率。根據現有的研究，一般認為注射病毒特異性siRNA、dsRNA會明顯抑制病毒的繁殖，注射非特異性siRNA、dsRNA可以誘發甲殼動物體內先天抗病毒免疫機制的發生，但是抗病毒效果不如特異性雙鏈RNA，且目前對蝦類研究較多。例如，Tirasophon等［53］發現在斑節對蝦體內注射dsRNA能誘導抗黃頭病毒（yellow head virus，YHV）的發生，且病毒特異性dsRNA誘導產生的抗病毒效果要好于非特異dsRNA。VP15和VP28分別是病毒的一種核衣殼蛋白和囊膜蛋白，在病毒增殖過程中具有潛在的重要功能。張衡等［54］分別將vp15 基因的特異性dsRNA（vp15-dsRNA）和非特異性dsRNA（gfp-dsRNA）與WSSA病毒共同注射到克氏原螯蝦（P. clarkia）體內，結果顯示vp15-dsRNA能特異性敲除vp15 的轉錄表達，有效抑制了WSSV病毒粒子的增值，進一步揭示vp15蛋白在WSSV增殖以及在病毒裝配過程中的重要性。Westenberg等［55］發現給斑節對蝦注射病毒VPl5、VP28特異性siRNA和非特異性的siRNA（綠色熒光蛋白GFP）均能引發特異的抗WSSV作用，但是后者的抗病毒作用不如特異性siRNA顯著。斑節對蝦抗菌肽penaeidin5（PenmonPEN5）可能是一種病毒應答基因，為研究其具體的功能，Woramongkolchai等［56］發現PenmonPEN5在斑節對蝦血細胞中表達量最高；預先在斑節對蝦體內注射PenmonPEN5 dsRNA，對照組注射poly（GC）或NaCl 溶液，隨后分別將WSSV病毒與PenmonPEN5 dsRNA，poly（GC）或NaCl共同注射，實驗組對蝦血細胞中VP28表達顯著上升，說明PenmonPEN5在斑節對蝦抗病毒機制中具有重要作用。整合蛋白（integrin）是細胞黏附受體超家族的成員，已證明可能在細胞吞噬和附著中具有重要重用，也可以促進細胞增殖和生存。Lin等［57］發現integrinβ幾乎在凡納濱對蝦所有組織中表達，在血細胞中表達量特別高；注射integrin β dsRNA后，發現integrinβ發生沉默，對蝦體內透明細胞、顆粒細胞數目，血細胞計數和溶菌酶等活性下降，說明integrin β參與凡納濱對蝦的細胞吞噬過程，在對蝦的免疫防御機制中具有重要地位。這些研究結果對于深入了解甲殼動物病毒防治具有重要的意義。

但也有研究顯示非特異性雙鏈RNA對于抗病毒并無明顯作用。肖瑾［58］用siRNA、dsRNA和幾種免疫刺激物，注射到凡納濱對蝦體內，研究其引發的RNAi作用以及非特異性dsRNA可能引起的先天免疫反應發現，特異性的siRNA能顯著的降低目的基因的表達量和對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的擴增速度，在一定程度上能延緩對蝦的死亡時間，效果隨著注射量的增加而加強；而非特異性的siRNA對于抗WSSV并無作用。Tirasophon等［59］向感染黃頭病毒YHV 的斑節對蝦注射YHV蛋白特異性dsRNA發現，病毒的復制被明顯抑制，但注射非特異性GFP dsRNA 不能抑制病毒復制，說明只有病毒特異性序列才能誘導RNAi的發生。這些研究結果說明非特異性雙鏈RNA能否誘導RNAi或甲殼動物體內先天免疫機制的發生可能存在物種差異性，需要進一步的研究來探討。

3 展望

目前，RNAi在甲殼動物的相關研究中有了越來越廣泛的應用。RNAi作為一種新型技術可以通過dsRNA高效抑制或阻斷特異性靶基因表達，代替了傳統的眼柄或組織切除手術，有效減少實驗體的損傷并提高實驗對象的存活率。該技術很可能在今后作為甲殼動物研究的一個突破口，在新基因的發現、基因功能的研究、信號轉導通路的闡明中發揮重大作用。由于甲殼動物體內只有非序列特異性的先天免疫防御應答，缺少脊椎動物的獲得性免疫應答反應，且目前對甲殼動物的病毒防御機制尚未研究透徹，在養殖業中（特別是對蝦養殖）缺乏有效的防治病毒的技術手段。所以RNAi被認為是一種具有廣闊實用前景的新型抗病毒技術，未來可能在甲殼動物養殖業的抗病毒中發揮重要作用。雖然近幾年的研究已經表明特異性雙鏈RNA對于抗病毒具有明顯作用，但是基本采用直接注射的方法。注射法高效誘導特異性RNAi的發生，但每次注射體積有限，若要大批量應用或持續注射，會耗費大量時間和人力。若能在今后建立一個有效的飼喂方式，通過簡單的喂食將雙鏈RNA導入試驗對象體內，或是能在甲殼動物體內構建一種長期性表達病毒特異性雙鏈RNA的體系，有望大批量用于實踐養殖中，促進甲殼動物的研究和經濟蝦蟹類物種的養殖業發展。

此外，由于甲殼動物方面的RNAi研究基礎相對較為薄弱且研究物種較單一，目前缺乏體外培養用細胞系。為了今后甲殼動物的分子研究、抗病毒和資源利用的進一步發展，有必要盡快開展細胞培養研究和建立甲殼動物細胞系。

綜上所述，隨著對甲殼動物RNAi 研究的不斷深入，相信RNAi技術將在甲殼動物的功能基因組學、基因表達調控機制及信號傳導通路、病毒防治等方面發揮重要的作用，大力推動甲殼動物研究進展。

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（責任編輯 狄艷紅）

Progress of Research and Application of the RNA Interference Technology in Crustacean

Qiu Xier Zhu Dongfa Zhou Yanqi Liu Zhiye Xie Xi
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211）

RNA interference（RNAi）is a phenomenon that the gene is post-transcriptionally inhibited by using specific double-stranded RNA（dsRNA）， gene silencing will be happened eventually. As a new technology， RNAi contributes to the understanding of the the functions and mechanisms of genes. RNAi is widely used in insects， fungus， plants and mammals， however， the reseachs on the crustacean are relatively less than the former. This review highlights the advancements of RNAi in crustaceans， including the study of methods， gene functions about CHH family， mechanisms of molting and gonadal regulation. In addition， RNAi plays an important role in an antiviral defense in crustacean.

RNA interference；crustacean；gene function；antiviral defense

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.008

2014-06-06

國家自然科學基金項目（41376152），浙江省自然科學基金項目（LY13C190006）

邱錫爾，女，碩士研究生，研究方向：甲殼動物發育生物學；E-mail：qxe2013@yeah.net

朱冬發，男，教授，研究方向：發育生物學和遺傳育種學；E-mail：zhudongfa@nbu.edu.cn