石榴皮多酚提取方法研究進展*

朱彩平，張艷霞，張曉，李云，鄧紅，翟希川，趙風(fēng)珠

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710062)

1 石榴研究及多酚提取概述

石榴(Punica granatum L.)為石榴科石榴屬植物，在熱帶及亞熱帶國家均有廣泛種植，不僅可食用，還被廣泛用作民間藥物［1-2］。石榴的果實主要由3部分組成:種子、果肉和果皮。石榴果汁由果肉榨得，因其被建議作為化學(xué)預(yù)防、化學(xué)治療、抗動脈粥樣硬化、消炎等制劑，目前在全球范圍內(nèi)其銷售量呈急劇增加的態(tài)勢［3-4］;石榴籽主要用于油的提取，石榴籽油具有抗氧化［5］、抗衰老［6］、增強免疫力［7］等功能，目前石榴籽油在市場上也開始銷售;石榴皮是石榴果汁和石榴酒等加工業(yè)的副產(chǎn)品，約占整個石榴果實鮮重的40%［8］，在我國，新鮮的石榴皮大部分被廢棄，僅有少量曬干作為藥用［9］。石榴皮中含有大量的多酚類物質(zhì)，是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，包括安石榴苷、沒食子酸、原兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁、槲皮素、山萘素等多種化合物［10］，約占石榴皮干重的10% ～20%。近10余年來的研究表明，它具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、抗菌、抗突變、降血脂、降血壓和潤膚美容等多種功效［11-16］，因此，石榴皮多酚在食品、醫(yī)藥及化工用品方面具有極大的應(yīng)用價值。

多酚類物質(zhì)的提取方法主要包括:溶劑提取、微波及超聲波輔助提取，酶法提取，超臨界流體萃取，超高壓流體萃取等。石榴皮多酚屬于不穩(wěn)定性物質(zhì)，易被氧化破壞，提取時間過長、溫度過高都會增加石榴皮多酚結(jié)構(gòu)被破壞的概率，低的提取效率不僅增加生產(chǎn)成本，還會降低石榴皮多酚的生物活性，因此，對石榴皮多酚的提取方法進行深入細致的研究，建立高效、快捷、經(jīng)濟、實用的提取方法顯得尤為迫切。本文對近年來石榴皮多酚的提取方法作一綜述。

2 石榴皮多酚提取方法

2.1 溶劑提取法

溶劑提取是最為傳統(tǒng)的多酚提取方法，根據(jù)植物中不同成分在不同溶劑中的溶解度不同而分離，所采用的溶劑主要是水或有機溶劑。

孫蘭萍［17］等利用乙醇提取石榴皮多酚，確定最佳的提取條件為:提取溫度70℃，液料比25∶1(mL∶g)，提取時間1.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，石榴皮多酚得率為16.28%。

王曉瑜［18］等采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水4種溶劑分別對新疆石榴皮總多酚進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取效果差別較大，總多酚得率:甲醇＞乙醇＞水＞乙酸乙酯。

李國秀［19］等以石榴皮粉為原料，研究了提取溶劑濃度、浸提溫度、浸提時間和料液比對多酚提取效果的影響，通過正交試驗對以上4個因素影響下的提取工藝進行了優(yōu)化，確定了石榴皮多酚乙醇提取的最佳工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸提溫度60℃、料液比1∶20(g∶mL)、浸提時間2 h，提取2 次，以此優(yōu)化工藝進行實驗，多酚得率為23.39%。

國外研究學(xué)者大多采用水作為提取溶劑，認(rèn)為水與有機溶劑相比價格低廉，對環(huán)境污染小。?am［20］等在用中心組合設(shè)計優(yōu)化石榴皮多酚水法提取的研究中，從可能對得率有影響的五個因素中剔除對得率影響不大的3個因素，最后選取提取溫度和提取時間兩個影響較大的因素進行優(yōu)化實驗，得到最佳提取條件為:提取溫度100℃，提取時間1 min，經(jīng)HPLC定量測定石榴皮總酚含量為192.0 mg/g干基，與采用傳統(tǒng)的甲醇溶劑提取沒有顯著性差異。

Amyrgialaki［21］采用響應(yīng)面優(yōu)化石榴皮多酚的提取工藝，試驗依據(jù)23全因子中心組合設(shè)計，以乙醇/水/檸檬酸為提取介質(zhì)，影響因素包括提取溶劑的pH，乙醇的濃度和提取時間。得到最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，pH 2，提取時間1 h，石榴皮總酚含量為324.9 mg/g干基。

采用溶劑法進行石榴皮多酚的提取時，可選取的溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水等溶劑，從節(jié)能環(huán)保及食用安全的角度來講，大多數(shù)研究者一般會選用低毒且價格相對低廉的乙醇或水作為溶劑，該方法簡單易行，但耗時較長，效率不高。

2.2 酶解提取法

酶解提取法是根據(jù)酶反應(yīng)具有高度專一性的特點，選擇相應(yīng)的酶，水解或降解細胞壁組成成分，從而破壞細胞，使細胞內(nèi)的有效成分更易于溶進溶劑中，達到對植物有效成分提取的目的。

王華斌［22］等人研究了酶法提取石榴皮中多酚的工藝，采用單因素試驗考察不同濃度的纖維素酶、果膠酶、復(fù)合酶(不同質(zhì)量比的纖維素酶和果膠酶)、酶解時間、酶解溫度及酶解液pH值對石榴皮多酚得率的影響，并運用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計優(yōu)化酶法提取石榴皮多酚的最佳工藝參數(shù)。試驗結(jié)果表明，對石榴皮多酚得率影響次序依次為酶解時間＞酶濃度＞pH值＞酶解溫度。當(dāng)復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比為2∶1)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，酶解時間150 min，酶解溫度50℃，初始酶解液pH 6.0時，多酚得率達23.87%。

酶法提取，條件溫和，產(chǎn)品得率較高，現(xiàn)在也越來越廣泛地應(yīng)用于食品、藥品及動植物細胞有效成分的提取，但提取時間較長。

2.3 微波輔助提取法

微波輔助提取是高頻電磁波到達物料內(nèi)部，由于吸收微波能，物料內(nèi)部迅速升溫，細胞瞬時破碎，被提取物進入提取介質(zhì)中，提高提取效率［23-24］。微波輔助提取法近年來廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提取，可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率，從而提高提取產(chǎn)率。

宋薇薇［25］等人采用微波輔助法提取石榴皮多酚類化合物，確定了石榴多酚提取的最優(yōu)工藝條件:40%(體積分?jǐn)?shù))乙醇作溶劑，料液比(g∶mL)1∶35，微波功率242 W，提取時間60 s，提取3次，以該優(yōu)化條件提取時，多酚粗提物的得率26.52%。

王玲［26］等人采用微波輔助水法提取石榴皮多酚，得出其粗提物的最佳提取工藝為:篩目數(shù)60～80目，提取功率385 W，料液比1∶25(g∶mL)，提取時間120 s，提取次數(shù)3次。在此條件下，石榴皮多酚得率最高達21.4%。

文春鵑［27］等人采用微波輔助乙醇提取石榴皮多酚的研究結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時間及料液比均對石榴皮多酚提取率有顯著影響。石榴皮多酚的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，微波功率 300 W，提取時間 120 s，料液比 1∶35(g∶mL)，該條件下石榴皮多酚提取率可達21.41%。

周安存［28］等人利用乙醇-硫酸銨雙水相體系與微波集成法對石榴皮多酚進行提取分離，通過單因素實驗與正交實驗得出提取石榴皮多酚的最佳條件為，m(料)∶V(醇)∶V(水)=1∶12∶20，(NH4)2SO4用量0.325 g/mL，微波處理溫度55℃，微波處理時間為60 s，粗多酚提取率為18.33%，粗提物中多酚含量為75.36%。

微波提取法是將微波與溶劑提取相結(jié)合，操作簡單易行，大大縮短了提取時間，但需要使用專門的微波提取設(shè)備，否則提取溫度無法控制。

2.4 超聲波輔助提取法

超聲波提取分離主要是依據(jù)物質(zhì)中有效成分和有效成分群體的存在狀態(tài)、極性、溶解性的不同來進行分離。超聲波振動能使溶劑快速地進入固體物質(zhì)中，將其物質(zhì)所含的有機成分盡可能完全地溶于溶劑之中，得到多成分混合提取液。超聲波還能在液體中高頻振動并產(chǎn)生“空穴作用”，可以破壞細胞組織，有助于多酚類化合物的溶出和擴散，具有提取時間短、效率高的優(yōu)點［29-30］。

Tabaraki［31］等人在超聲波輔助乙醇提取石榴皮多酚的研究中，選取對得率影響較大的3個因素提取時間、乙醇濃度和提取溫度為單因素，用響應(yīng)面法進行提取條件優(yōu)化，研究結(jié)果表明:當(dāng)提取溫度60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間30 min時，最高提取率為45.38%，較超聲輔助水法提取，其得率高3倍(Pan和Qu等人采用超聲輔助水法提取，其得率為11% ～ 14%［5，32］)。

房玉林［33］等人利用超聲波輔助甲醇法提取石榴皮多酚類物質(zhì)，結(jié)果表明:用80%酸化甲醇做溶劑、料液比1∶20(g∶mL)、30℃條件下超聲波(固定功率100 W)作用20 min，提取1次，總多酚提取率最高，為14.06 mg/g。

王華斌［34］等人以新疆石榴皮為原料，采用二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計對超聲波輔助乙醇提取石榴皮多酚工藝進行研究，結(jié)果表明，其最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶25(g∶mL)，超聲時間30 min，超聲功率360 W。在此優(yōu)化條件下，石榴皮多酚得率達到(21.2±0.06)%。

汝紹剛［35］等利用超聲輔助乙醇法提取石榴皮多酚的研究中，通過正交試驗優(yōu)化石榴皮多酚的最佳提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，石榴皮粒徑40目，提取時間50 min，提取溫度30℃，料液比為1∶15(g∶mL)，該條件下石榴皮多酚平均提取率為16.44%。

郭慶賀［36］等采用超聲波-螯合劑輔助提取石榴皮多酚，通過響應(yīng)面分析，確定超聲波-螯合劑輔助提取石榴皮多酚的最佳工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度60℃、提取時間50 min、料液比1∶30(g∶mL)、螯合劑添加量0.08%，在此條件下多酚提取率可達28.03%。超聲波-螯合劑輔助提取法與普通熱回流提取相比，具有雜質(zhì)少、耗時短、效率高等優(yōu)點，可作為石榴皮中多酚提取的新方法，具有廣闊應(yīng)用前景。

Pan［37］等人運用持續(xù)式超聲輔助和脈沖式超聲輔助2種方法分別提取石榴皮中的抗氧化物質(zhì)(主要是多酚類物質(zhì))，并將2種方法與傳統(tǒng)方法進行對比，以提取率和抗氧化活性的大小為指標(biāo)判斷最佳的提取方法和工藝條件，研究結(jié)果表明，在持續(xù)式超聲輔助提取(continuous ultrasound-assisted extraction，CUAE)中，得率與超聲強度和提取時間的變化呈正相關(guān)，但是提取時間的延長會嚴(yán)重影響提取物的抗氧化活性，而對于脈沖式超聲輔助提取(pulsed ultrasound-assisted extraction，PUAE)，超聲強度、脈沖重復(fù)次數(shù)、脈沖持續(xù)時間和脈沖間隔時間都會影響產(chǎn)品得率，但不會影響提取物的抗氧化活性，在超聲強度為59.2 W/cm2，提取時間60 min，溫度(25±2)℃，料液比1∶50(g∶mL)，PUAE的脈沖持續(xù)時間與間隔均為5 s的條件下，PUAE和CUAE提取得率接近(分別為14.5%和14.8%)，與傳統(tǒng)的提取方法相比，PUAE和CUAE的提取得率分別增加了22%、24%，提取時間分別縮短了87%、90%。此外，PUAE可比CUAE節(jié)約50%的電能，鑒于此，作者推薦PUAE為提取石榴皮中抗氧化物質(zhì)的最佳方法。

以上不同學(xué)者雖然都是采用超聲輔助提取石榴皮多酚，但是所用溶劑、提取條件不盡相同，因此多酚得率也存在著較大差異。

超聲波輔助提取法也是將超聲波與溶劑提取相結(jié)合，可大大節(jié)省提取時間，提高提取效率。

2.5 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取是一種新型的現(xiàn)代分離技術(shù)，它是利用溫度和壓力略超過或接近臨界的介于氣體和液體之間的流體作為萃取劑，從固體或液體中萃取某種高沸點和熱敏性成分，以達到分離和提純的目的［38］。目前，超臨界CO2萃取技術(shù)用于石榴皮多酚提取的報道還很少。

馮務(wù)群［39］等用超臨界CO2萃取，超聲提取，微波提取及甲醇浸提等不同方法提取石榴皮中沒食子酸并用HPLC法測定其含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種方法提取所得沒食子酸含量分別為 0.498%、0.311%、0.271%和0.396%，因此超臨界CO2萃取法提取石榴皮多酚中沒食子酸是一種高效的方法。

超臨界萃取是近年來研究較多的一種新的先進的提取方法，主要適合提取非極性和弱極性的低分子成分，對于極性成分的提取，可通過加極性夾帶劑的方式改善和提高提取率。沒食子酸(3，4，5-三羥基苯甲酸)含多個極性基團，是強極性化合物，適合使用極性溶劑作為夾帶劑提取，甲醇是常用的極性溶劑，馮務(wù)群［39］等人采用甲醇作夾帶劑，提取得到的沒食子酸含量在4種提取方法中最高。

超臨界流體萃取是一種高效而環(huán)保的提取方法，已被廣泛運用于實驗室研究，但是它在萃取過程中成本較為昂貴［40-42］。目前最新研究發(fā)現(xiàn)，亞臨界水萃取可將其替代［43］。

2.6 亞臨界水萃取

亞臨界水又稱超加熱水、高壓熱水或熱液態(tài)水，是指在一定的壓力下，將水加熱到100℃以上，374℃以下的臨界溫度高溫，水體仍然保持在液體狀態(tài)。亞臨界狀態(tài)下流體微觀結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子水合、離子締合、簇狀結(jié)構(gòu)等發(fā)生了變化，因此亞臨界水的物理、化學(xué)特性與常溫常壓下的水在性質(zhì)上有較大差別。常溫常壓下水的極性較強，亞臨界狀態(tài)下，隨著溫度的升高，亞臨界水的氫鍵被打開或減弱，從而使水由高到低萃取出來。這樣就可以通過控制亞臨界水的溫度和壓力，使水的極性在較大范圍內(nèi)變化，從而實現(xiàn)天然產(chǎn)物中有效成分從水溶性成分到脂溶性成分的連續(xù)提取，并可實現(xiàn)選擇性提取。此外，由于亞臨界水萃取是以價廉、無污染的水作為萃取劑，因此，亞臨界水萃取技術(shù)被視為綠色環(huán)保、前景廣闊的一項變革性技術(shù)［43］。

He［44］等人在用亞臨界水提取石榴渣多酚物質(zhì)的研究中，以提取時間、料液比和溫度作為單因素，研究結(jié)果表明最佳的提取條件為:提取時間30 min，料液比1∶40(g∶mL)，溫度220℃，溫度對提取率的影響最大，在溫度100～220℃內(nèi)，多酚含量在651.7～4 854.7(mg/100g干基)內(nèi)變化。

亞臨界水提取一種先進的新型提取技術(shù)，較傳統(tǒng)提取方法的優(yōu)點有:提取時間短，工藝簡單，成本低廉，提取率高，環(huán)保［43］。

2.7 超高壓提取法

超高壓提取也稱超高冷等靜壓提取，是指在常溫下用100～1 000 MPa的流體靜壓力作用于提取溶劑和中藥的混合液上，并在預(yù)定壓力下保持一段時間，使植物細胞內(nèi)外壓力達到平衡后迅速卸壓。由于細胞內(nèi)外滲透壓力忽然增大，細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得細胞內(nèi)的有效成分能夠穿過細胞的各種膜而轉(zhuǎn)移到細胞外的提取液中，達到提取有效成分的目的。最新研究表明在天然產(chǎn)物的提取中應(yīng)用它可大大縮短提取時間，減少雜質(zhì)溶出，提高有效成分的得率，避免因熱效應(yīng)引起的有效成分的變化，并且不會對環(huán)境造成污染［45］。

嚴(yán)隴兵［45］等人以提取石榴皮多酚為目的，以總酚得率為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計優(yōu)化超高壓溶劑提取工藝參數(shù)，試驗結(jié)果表明:影響超高壓提取石榴皮多酚得率的因素主次順序為:料液比＞壓力＞乙醇濃度＞保壓時間。最佳提取工藝條件為提取壓力582.7 MPa，保壓時間 2.3 min，料液比1∶41(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)52.8%，在此條件下，多酚得率超過26%。

除超高壓外，也有采用一般高壓溶劑提取的，?am［8］等人在高壓水提取石榴皮多酚的研究中，提取容器內(nèi)壓力保持在102.1個大氣壓(約10 MPa)，發(fā)現(xiàn)石榴皮原料粒徑大小、高壓處理溫度和靜電干擾時間是影響石榴皮多酚提取率的主要因素，研究結(jié)果表明，最佳的提取溫度為40℃，靜電干擾時間為5 min，粒徑可盡量小但不宜小于65 μm，其安石榴苷含量為(116.6±12.2)mg/g干基。同時作者還將高壓水提取與采用不同溶劑在常壓下提取(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮及水)進行比較，結(jié)果顯示甲醇提取得到的總酚含量(252.4 mg/g干基)顯著高于其他溶劑提取(3.9～96.8 mg/g干基)，而高壓水方法提取的總酚含量與甲醇提取的總酚含量相當(dāng)(258.2 mg/g干基)。

在常壓溶劑提取中，甲醇提取雖然總酚提取率高，但甲醇試劑具有一定毒性，用量大，成本高，且產(chǎn)品中殘留的溶劑不易徹底去除，而常壓水提取，雖無溶劑殘留污染，但耗時長，且因水溫偏高，多酚為熱敏性成分，其結(jié)構(gòu)易被破壞，而導(dǎo)致總酚提取率較低，若采用高壓水提取，則能很好的彌補以上方法的不足，因此采用高壓或超高壓的方法提取石榴皮多酚具有較大的優(yōu)勢。

3 結(jié)語

石榴皮多酚因具有多種生物活性，其開發(fā)應(yīng)用前景被看好。充分利用石榴資源，建立一種高效低廉的石榴皮多酚提取工業(yè)化生產(chǎn)工藝，既能為開發(fā)石榴皮多酚這一天然活性成分在食品、保健品和化工用品等領(lǐng)域的新用途提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為石榴皮資源的再利用提供一條可行途徑，提高石榴加工業(yè)的附加值，促進石榴種植和加工的協(xié)調(diào)發(fā)展。

傳統(tǒng)的溶劑提取法及酶法提取研究較為成熟，但溶劑的耗費量較大，成本高，提取時間長，提取率低，已成為阻礙我國石榴皮多酚資源開發(fā)利用的瓶頸。近幾年采用較多的是微波和超聲波輔助溶劑浸提來提取石榴皮多酚，以此達到節(jié)省提取時間、提高提取率的目的。最新的方法如超臨界流體萃取、超高壓萃取、亞臨界水提取等技術(shù)，比現(xiàn)有方法具有更大的優(yōu)越性，為工業(yè)化提取石榴皮多酚開辟了新的途徑。然而這些技術(shù)目前多限于實驗室研究，還不適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，為了加快我國豐富的石榴資源的綜合開發(fā)利用，尋求新的快速、高效、節(jié)能減排的提取方法，改進現(xiàn)有的能夠適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的提取工藝顯得極為重要。

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