化瘀解毒益氣法對慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠胃黏膜細胞PCNA水平和凋亡狀況的干預研究*

彭繼升，楊晉翔，安 靜，魏 玥，賀梅娟

(1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

·實驗研究·

化瘀解毒益氣法對慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠胃黏膜細胞PCNA水平和凋亡狀況的干預研究*

彭繼升1，楊晉翔1，安 靜1，魏 玥1，賀梅娟2

(1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

目的：觀察以化瘀解毒益氣法為治則的中藥消痞顆粒對慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)伴異型增生大鼠胃黏膜細胞增殖和凋亡的影響。方法：以MNNG癌誘變劑灌胃為主多因素聯(lián)合建立CAG伴Dys大鼠模型，按體質量隨機分成自然恢復組、維酶素組與中藥組，分別給予生理鹽水、維酶素懸濁液、消痞顆粒灌胃，并與正常對照組大鼠對照。干預階段持續(xù)12周，觀察各組大鼠胃黏膜病理變化、免疫組化檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)水平、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定[terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL]法檢測胃黏膜上皮細胞凋亡狀況。結果：中藥組治療后與自然恢復組胃黏膜病理存在顯著差異(P<0.05)，維酶素組與自然恢復組無明顯差異(P>0.05)；消痞顆粒組凋亡指數(shù)顯著低于自然恢復組和維酶素組(P<0.01,P<0.05)。自然恢復組和維酶素組間無顯著性差異；消痞顆粒組PCNA表達的陽性比與維酶素組、自然恢復組間均存在顯著差異(P<0.05,P<0.01)；而維酶素組與自然恢復組間并無顯著性差異(P>0.05)。結論：消痞顆粒可改善CAG伴Dys大鼠胃黏膜的病理變化，降低其凋亡指數(shù)及PCNA表達。

化瘀解毒益氣法；慢性萎縮性胃炎/藥物作用；細胞增殖；細胞凋亡；消痞顆粒/治療應用；動物模型，大鼠

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，一般認為胃癌的演變規(guī)律為：正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌(腸型)[1]。異型增生是目前公認的胃癌癌前病變，基本認為其病變是不可逆的，但阻斷其繼續(xù)向胃癌的發(fā)展，仍是目前防治胃癌的研究關鍵。胃黏膜細胞的增殖和凋亡失衡在慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)向胃癌發(fā)展過程中扮演著重要角色。前期研究[2]顯示:中藥消痞顆粒以化瘀解毒益氣法為治則，對胃癌前病變有著確定的臨床療效，并可有效干預CAG伴不典型增生大鼠的抑癌基因。本實驗主要通過免疫組化檢測增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定[terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL]法檢測胃黏膜上皮細胞凋亡狀況，觀察消痞顆粒對異型增生大鼠胃黏膜細胞增殖和凋亡狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體Wistar實驗用雄性大鼠60只，4周齡，體質量約100 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物批號：SCXK(京)2012-0001。清潔級普通飼料、清潔級加藥飼料(由普通飼料添加質量分數(shù)0.03%的鹽酸雷尼替丁)均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 藥品、試劑與儀器

消痞顆粒劑由黨參、炙百合、烏藥、香櫞皮、丹參、三七粉、莪術、蒲公英、白花蛇舌草組成，由北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥劑科制成顆粒沖劑，12 g/袋，每克沖劑含生藥9 g。根據(jù)實驗需要配制成0.6 g/mL(含生藥3 g/mL)的藥液，裝入器皿中，放置在4 ℃冰箱中以備用。維酶素片,河北環(huán)海藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號20090506；N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，日本東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品，編號M0527；質量分數(shù)28%氨水，西隴化工有限公司產(chǎn)品，批號1503232，CAS登陸號1336-21-1，臨用配制成質量分數(shù)0.5 g/L的氨水溶液。鹽酸雷尼替丁膠囊，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為0.15 g/粒，批號100902256。戊巴比妥鈉，美國Sigma 公司產(chǎn)品，CAS登陸號57-33-0，貨號P376，根據(jù)取材需要量配置成10 g/L溶液備用。PCNA (PC10) Mouse mAb，Cell Signaling Technology, Inc產(chǎn)品，產(chǎn)品編號2586s；細胞凋亡試劑盒(In Situ Cell Apoptosis Detction Kit I,POD)，產(chǎn)品編號11684817910，羅氏Roche產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

60只大鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周，按體質量隨機分為兩組。正常對照組10只，以清潔級動物標準提供普通飼料喂養(yǎng)，持續(xù)至實驗結束；造模組50只，如下述造模方法和飼養(yǎng)條件進行干預。模型的建立參照相關文獻[3]及前期實驗經(jīng)驗[4]，以MNNG癌誘變劑灌胃為主、多因素聯(lián)合建立慢性萎縮性胃炎伴異型增生大鼠模型。動物于實驗動物室屏蔽環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每5只分為1籠，正常光照條件，明暗周期 12/12 h，室溫(25±3)℃，相對濕度(50±5)%。模型組大鼠自由飲用質量分數(shù)為0.5 g/L氨水溶液(每24 h新鮮配制并更換1次)，自由進食質量分數(shù)0.3 g/L鹽酸雷尼替丁清潔級大鼠飼料，予120 mg/L的MNNG溶液灌胃，每只5μL/(g·d)。于實驗第20，24，26，28，30，32周末分別隨機抽檢2只動物。第32周末造模成功，造模結束。第33周始將造模組剩余的33只大鼠按體質量隨機分成自然恢復組、維酶素組和消痞顆粒組3組，每組11只。以清潔級動物標準提供普通飼料和水。自然恢復組予生理鹽水3 μL/(g·d)灌胃；維酶素組予維酶素懸濁液2 μL/(g·d)(即維酶素0.3 g/kg)灌胃；消痞顆粒組予消痞顆粒懸濁液3 μL/(g·d)(含生藥9 g/kg)灌胃。干預階段持續(xù)12周。所有實驗大鼠于第44周末處死。

1.4 檢測指標

1.4.1 取 材

于實驗第44周末取材。取材前各組大鼠禁食不禁水18 h。以質量分數(shù)10g/L的戊巴比妥鈉按30 μg/g經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠；迅速沿大彎側剪開，40 g/L 生理鹽水漂洗內(nèi)容物；再沿小彎側剪開；用濾紙吸干水分；切取病變胃黏膜組織，切取胃竇組織；甲醛固定，石蠟包埋，用于病理切片、免疫組化檢測及TUNEL檢測。

1.4.2 胃黏膜組織病理變化

采用常規(guī)HE染色，病理分析標準采用2000年全國慢性胃炎研討會共識意見[5]和2006年全國慢性胃炎共識意見中的病理診斷標準[6]，分為正常、輕度、中度、重度4個等級。

1.4.3 細胞凋亡指數(shù)、PCNA蛋白表達

操作步驟參照張玲霞等[7]的報道。細胞核呈棕褐色著染或細胞漿因核 DNA逸出呈陽性著染者, 為凋亡細胞。每張切片觀察5個視野, 每個視野計數(shù)100 個細胞核, 計數(shù)中凋亡細胞比率的均數(shù)為凋亡指數(shù)。采用免疫組化法檢測。具體步驟：①常規(guī)脫蠟和水化。②抗原修復：0.1 mL/L Triton 浸潤15 min(每片100 μL)；0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3；30 mL/L H2O2-CH3OH浸潤10 min，0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3；微波抗原修復10 min，自然冷卻到室溫；0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3；加山羊血清浸潤20 min；將山羊血清甩去，滴加Ⅰ抗(稀釋200倍)，放于冰箱中，4 ℃過夜；從冰箱中將切片去除，在室溫中放置30 min，0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3；滴加Ⅱ抗，在37 ℃的溫度下浸潤20 min，0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3。③顯色：滴加SABC，在37 ℃的溫度下浸潤20 min，0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3；DAB顯色10 min，鏡下觀察；自來水沖洗，ddH2O沖洗；蘇木精復染1 s，0.01 mol/L PBS 浸潤3 min×3。④脫水封片。免疫組化結果的判定標準：PCNA陽性染色為棕褐色顆粒。在高倍鏡(×40)視野隨機選取5個視野攝像，使用IPP7.0圖像分析軟件進行圖像分析，并計算總面積內(nèi)的平均光密度值，進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 大鼠死亡情況

造模階段：造模組大鼠共抽檢12只，死亡5只；正常對照組大鼠無死亡。第16周造模組出現(xiàn)1只大鼠死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)肺水腫，考慮為灌胃不當所致。造模組第24，28周各有1只大鼠分別于右下腋、右后頸項部出現(xiàn)皮下腫物，包膜完整，其中1只大鼠病理檢查示類子宮內(nèi)膜樣組織；第30，32周各有1只大鼠死亡，肺部組織出現(xiàn)輕、中度感染，肺間質肺炎。

干預階段：共43只大鼠進入干預階段，自然恢復組、消痞顆粒組、維酶素組各11只，正常對照組10只。消痞顆粒組與正常對照組均無大鼠死亡，自然恢復組死亡3只，維酶素組死亡2只。5只大鼠死亡前體質量下降明顯，腹脹明顯，解剖結果示死亡由全胃腸道脹氣所致，尤其回盲部明顯；3只大鼠可聞及明顯喘鳴音，口鼻處有血性或黏性分泌物，解剖后肺組織病理確診肺部有感染，有大量炎性細胞浸潤。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理改變對比

造模階段模型組：實驗第20周，1只大鼠胃黏膜固有腺體上皮細胞出現(xiàn)核分裂象，判斷出現(xiàn)異常增生，另一只大鼠未出現(xiàn)異型增生，繼續(xù)實驗的造模部分。實驗第24周，胃竇部黏膜僅出現(xiàn)炎癥反應，有少量以淋巴細胞為主的慢性炎癥細胞浸潤，余無明顯異常病變。實驗第26周末，模型組抽檢大鼠胃黏膜除炎性細胞浸潤外出現(xiàn)黏膜變薄，黏膜肌層增厚，固有腺體減少。實驗第28周末，模型組抽檢大鼠除胃黏膜慢性炎癥反應、黏膜變薄及腺體減少外，出現(xiàn)腸上皮化生。實驗第30周，1只大鼠病理切片示胃竇部出現(xiàn)異型增生，另1只大鼠胃竇部未出現(xiàn)異常增生。實驗第32周，2只大鼠病理切片示胃竇部均出現(xiàn)異常增生。見圖1。

實驗第44周末，自然恢復組大鼠胃竇部及胃體底部黏膜上皮萎縮變薄，腺體數(shù)量減少，間質內(nèi)有淋巴細胞浸潤，偶見單核細胞、嗜酸性白細胞，可見淋巴濾泡形成和腸上皮化生，以及不同程度的異型增生，表現(xiàn)為細胞大小、形態(tài)不均一，結構不規(guī)整，核漿比例顯著增大，出現(xiàn)核分裂，個別腺體呈共壁形象或囊性擴張，見圖2。維酶素組大鼠胃竇部及胃體黏膜仍有淋巴細胞浸潤，表現(xiàn)為程度不等的慢性淺表性、萎縮性胃炎等改變，較自然恢復模型組輕，見圖3。消痞顆粒組大鼠胃竇部及體部黏膜上皮排列規(guī)整，腺體大小、形態(tài)較均一，偶有淋巴細胞浸潤，見圖4。正常對照組大鼠胃黏膜層厚度正常，胃黏膜上皮細胞呈單層柱狀，胞漿透明或呈小空泡狀，與腺管分界清楚，腺管結構排列整齊，大小、形狀均一，見圖5。

胃黏膜中、重度異型增生圖1 實驗第32周大鼠胃黏膜組織病理改變 (HE，×10)

胃竇部重度異型增生，腺體結構異常，腺體排列不整齊，有囊性擴張圖2 實驗第44周末自然恢復組大鼠胃黏膜組織病理改變(HE，×20)

胃黏膜腺體結構異常，腺體排列不整齊，輕度腸上皮化生，中度異型增生圖3 實驗第44周末維酶素組大鼠胃黏膜組織病理改變(HE，×4)

胃黏膜腺體增生不明顯，有輕度炎癥，胃黏膜接近正常圖4 實驗第44周末消痞顆粒組大鼠胃黏膜組織病理改變(HE，×10)

胃黏膜正常圖5 實驗第44周末正常對照組大鼠胃黏膜組織病理改變(HE，×20)

經(jīng)統(tǒng)計學分析：正常對照組與其余各組病理情況對比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。消痞顆粒組與自然恢復組間差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。維酶素組與自然恢復組間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。消痞顆粒組與維酶素組間差別亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組干預結束后階段病理變化情況

表1 各組干預結束后階段病理變化情況

組 別例數(shù)異型增生輕度中度重度合計正常對照組1000010自然恢復組12238??維酶素組32229??消痞顆粒組722011?#

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與自然恢復組對比，#P<0.05

2.3 各組大鼠細胞凋亡指數(shù)對比

正常大鼠胃黏膜中，凋亡細胞主要位于表面上皮內(nèi)，呈簇狀分布或單個散在分布。自然恢復組、維酶素組凋亡細胞的陽性反應物質為棕黃色,位于細胞核內(nèi),濃縮的核質緊貼于核膜,或核質呈現(xiàn)均勻的染色。其余3組模型大鼠凋亡細胞數(shù)明顯增多，高于正常對照組大鼠，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。消痞顆粒組凋亡指數(shù)也低于自然恢復組和維酶素組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。自然恢復組和維酶素組間差別亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠細胞凋亡指數(shù)對比

表2 各組大鼠細胞凋亡指數(shù)對比

組 別動物數(shù)/只凋亡指數(shù)正常對照組100．065±0．010自然恢復組80．303±0．016???維酶素組90．288±0．009???##消痞顆粒組110．275±0．014???###△△

注：與正常對照組對比，** *P<0.01；與自然恢復組對比，##P<0.05，###P<0.01；與維酶素組對比，△△P<0.05。

2.4 各組大鼠PCNA蛋白表達水平對比

各組大鼠胃黏膜均出現(xiàn)PCNA陽性顯色。正常對照組黏膜陽性細胞較少，主要位于增殖帶，分布規(guī)律，著色弱。模型組陽性細胞增多，全層均有表達，著色加深，不典型增生部位陽性細胞數(shù)明顯增多。消痞顆粒組陽性細胞明顯減少。經(jīng)圖像軟件處理，定量分析顯示：與正常對照組對比，其余3組大鼠PCNA蛋白表達增高，差別有統(tǒng)計意義(P<0.01)。消痞顆粒組PCNA蛋白表達水平較維酶素組、自然恢復組低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。維酶素組與自然恢復組間PCNA蛋白表達水平對比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠PCNA蛋白表達水平對比

表3 各組大鼠PCNA蛋白表達水平對比

組 別動物數(shù)/只PCNA蛋白表達正常對照組100．150±0．011自然恢復組80．337±0．016???維酶素組90．330±0．011???#消痞顆粒組110．314±0．024???###△△

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與自然恢復組對比，#P>0.05,###P<0.01；與維酶素組對比，△△P<0.05。

3 討 論

據(jù)調查，我國20世紀90年代胃癌死亡占惡性腫瘤死亡的23.2%，并且在過去的20年中，呈上升趨勢[8]，因此，胃癌是目前腫瘤防治的重點。目前一般認為，胃癌是由癌前病變逐步發(fā)展形成的[9]，利用各種干預手段積極治療癌前病變對防治胃癌的發(fā)生具有重要意義[10]。CAG是胃癌的癌前疾病，胃癌前病變是多因素、多階段綜合作用下，逐步緩慢進展的長期過程。長期慢性刺激、反復損傷導致慢性胃黏膜炎癥反應，組織不斷修復增生是形成胃癌前病變的充要條件。胃黏膜細胞的增殖和凋亡失衡在CAG向胃癌發(fā)展過程中扮演著重要角色。

維持胃黏膜的正常結構依賴于胃黏膜細胞喪失和更新的動態(tài)平衡。正常的細胞凋亡機制可以清除機體內(nèi)受損、變異和衰老的細胞。研究表明,在從正常胃黏膜到萎縮性胃炎過程中,細胞凋亡指數(shù)及細胞增殖指數(shù)均呈遞增趨勢,細胞凋亡與細胞增殖呈正相關[11]。TUNEL法是檢測細胞凋亡的常用方法，可對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確地反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征。增殖細胞核抗原(PCNA)是一種僅在增殖細胞中合成與表達的36 kD多肽。已證明PCNA表達與細胞增殖周期有關。G1期PCNA表達逐漸增加，S期達到高峰，而G2/M期減少[12]。檢測PCNA指數(shù)對了解癌細胞的增殖狀態(tài)有很高的價值，PCNA表達越強,細胞惡化程度越高[13]。

筆者認為萎縮性胃炎伴胃黏膜異型增生是毒、瘀、虛共同、長期積累的結果，尤其是毒致胃黏膜發(fā)生異型增生，因此，提出毒損胃絡是胃黏膜異型增生的重要病機。筆者臨床中應用這一理論辨證論治，發(fā)現(xiàn)對胃黏膜異型增生的逆轉有理想的療效[14-16]。消痞顆粒是筆者多年來研究的化瘀解毒益氣的方劑，由黨參、炙百合、烏藥、香櫞、丹參、三七、莪術、蒲公英、白花蛇舌草組成，可有效治療萎縮性胃炎伴胃黏膜異型增生，逆轉胃癌癌前病變[17]。本實驗中消痞顆粒組大鼠胃黏膜細胞病理改變較維酶素組、自然恢復組為輕，圖像分析示消痞顆粒組PCNA表達及凋亡指數(shù)均低于維酶素組及自然恢復組，表明消痞顆粒可有效地干預萎縮性胃炎病變大鼠的胃黏膜細胞增殖和凋亡狀況。此為消痞顆粒有效阻止萎縮性胃炎向癌變發(fā)生提供了一定理論支持。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0049-05

R573.3+2

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.26

彭繼升(1980-)，男(漢族)，山東聊城人，北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院脾胃病科副主任醫(yī)師，博士，主要從事消化代謝疾病的中醫(yī)藥防治。

2012年北京中醫(yī)藥大學青年教師專項計劃(2012-QNJSZX024)

2014-09-11；

2015-01-05