新加糖腎康對高糖環境下HK-2細胞外基質成分沉積的作用研究*

朱苗蕊，楊麗霞，薛建軍，程 濤，田廣芳，張定華，劉銅華

(1.蘭州石化總醫院，甘肅 蘭州 730060； 2.甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050； 4.北京中醫藥大學，北京 100029)

·實驗研究·

新加糖腎康對高糖環境下HK-2細胞外基質成分沉積的作用研究*

朱苗蕊1，楊麗霞2，薛建軍3，程 濤2，田廣芳3，張定華3，劉銅華4

(1.蘭州石化總醫院，甘肅 蘭州 730060； 2.甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050； 4.北京中醫藥大學，北京 100029)

目的：通過觀察新加糖腎康(簡稱TSK)對高糖誘導人腎小管上皮細胞(HK-2)的細胞外基質成分Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)和纖連蛋白(FN)的作用，探討其在防治糖尿病腎間質纖維化方面的作用。方法：將體外培養的HK-2 細胞分為 6 組：空白對照組、高糖誘導組(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清對照組(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加TSK低濃度組(30 mmol/L D-葡萄糖+5% 新加TSK藥物血清)、新加TSK中濃度組(30 mmol/L D-葡萄糖+10% 新加TSK藥物血清)、新加TSK高濃度組(30 mmol/L D-葡萄糖+20% 新加TSK藥物血清)。藥物干預后，ELISA法檢測ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量。結果：高糖誘導后細胞外基質成分顯著增加，與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。但經新加TSK干預后其含量開始下降，與高糖誘導組相比有顯著性差異(P>0.05)。結論：中藥復方新加TSK能夠抑制腎小管上皮細胞外基質成分的分泌，具有防治糖尿病腎間質纖維化的作用。

新加糖腎康/藥效學；高糖/藥物作用；人腎小管上皮細胞；細胞外基質成分；動物模型，大鼠

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發癥之一，其發病機制尚未明確。既往研究認為DN的早期病變在腎小球，近年來研究發現腎小管病變引起的間質纖維化與其關系更為密切，故腎間質纖維化的干預在DN的治療中越來越受到重視[1]。腎間質纖維化的主要特征是細胞外基質成分沉積，因此抑制細胞外基質成分的分泌對腎間質纖維的治療有重要意義。本課題所選中藥復方糖腎康是甘肅省中醫院劉國安教授和張定華主任醫師在多年臨床積累的基礎上，經過反復的藥物篩選，最終確立的臨床經驗方，具有益氣養陰、清熱祛濕、活血化瘀的功效。既往研究結果表明：糖腎康膠囊能夠改善2型糖尿病患者血流動力學指標，減少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，對DN具有一定的治療作用[2]。本課題在此研究基礎上，結合北京中醫藥大學劉銅華教授治療DN的學術思想[3]，對組方進行了優化，新增一味活血化瘀藥水蛭組成新加糖腎康(簡稱TSK)，通過觀察其干預高糖誘導體外培養人腎小管上皮細胞的細胞外基質成分的分泌，探討其對DN腎間質纖維化的作用，為其臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人腎小管上皮細胞株(HK-2)購于上海斯信生物科技有限公司。

1.2 動 物

雄性SPF級Wistar大鼠20只，體質量(200±20)g，購于甘肅中醫學院動物中心，許可證號：SCXK(甘)2004-0006。大鼠飼養于甘肅省中醫藥研究院中藥研究所動物室，普通飼料喂養。

1.3 藥品、試劑與儀器

新加糖腎康由黃芪、生地黃、水蛭等組成，中藥材由甘肅省中醫院藥劑科提供，用時水提醇沉。1640細胞培養基(批號1237579)、胎牛血清(批號12657-029),均為Gibco公司產品；人ColⅠ(批號E1378Hu)、Col Ⅲ(批號E1375Hu) 和FN ELISA試劑盒(批號E2002Hu)，均為上海晶天生物科技有限公司產品；D-葡萄糖，汕頭西隴化工廠有限公司產品，批號0810142，根據文獻配制為30 mmol/L的溶液[4]。 SANYO MCO-18AIC型CO2培養箱,產地日本；SW-CJ-2FD超凈生物安全柜，產地中國；Olympus IX51型倒置顯微鏡,產地日本；Labsystems Multiskan MS 352型酶標儀，產地芬蘭。

1.4 新加糖腎康藥物血清制備

隨機分為空白組、新加糖腎康組，每組10只。新加糖腎康組按成人臨床用量的6.5倍灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水。每次10μL/g體質量，上、下午各1次，灌胃3 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃30 min后大鼠股動脈采血，靜置2 h后3 000 r/min冷凍離心20 min，取上清，-20 ℃保存，用時與培養基配成所需濃度。

1.5 細胞培養與分組

HK-2 細胞用含體積分數100 mL/L胎牛血清的1640培養基培養于 37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養箱中。每隔 1～2 d換新鮮培養基1次，培養融合至 80 % 以上，用含 0.25 % 胰蛋白酶、0.05% EDTA 的消化液消化后，用新鮮培養基將細胞重懸后進行傳代培養。實驗前先用無血清培養基培養24 h使細胞同步化，實驗重復3次。

細胞分為6組。①空白對照組：1640培養液；②高 糖誘導組：1640培養液+30 mmol/L D-葡萄糖；③空白血清對照組：1640培養液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清；④新加糖腎康低濃度組：1640培養液+30 mol/L D-葡萄糖+5%TSK藥物血清；⑤新加糖腎康中濃度組：1640培養液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%TSK藥物血清；⑥新加糖腎康高濃度組：1640培養液+30mmol/L D-葡萄糖+20%TSK藥物血清。

1.6 檢測指標

采用ELISA法檢測ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量。細胞接種于24孔板，每孔1 mL，每組設2個復孔，培養過夜。按分組加入含相應濃度藥品的培養液，每孔1 mL。分別于24 h、48 h收集細胞上清，4 ℃離心20 min(2 000 r/min),取上清，-20 ℃保存待測。指標檢測按照ELISA試劑盒說明書進行。取出細胞上清，在試劑盒包被反應條每孔加入不同質量分數的標準品或待測標本，空白對照孔加稀釋液100 μL，37 ℃孵育、洗滌、加酶標抗體和終止反應。在酶標儀上450 nm處，以空白對照孔調零，直接測定各孔OD值及樣品濃度值。

1.7 統計學方法

2 結 果

ELISA實驗結果顯示：HK-2細胞經高糖誘導24 h、48 h后，ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量增加，與空白對照組對比，差別有統計學意義(P<0.05)；但經糖腎康藥物血清干預后，其含量開始減少，特別是高濃度效果更為明顯，與高糖誘導組對比，差別有統計學意義(P<0.05)，而空白血清沒有類似作用。結果表明：糖腎康能夠抑制高糖環境下人腎小管上皮細胞分泌細胞外基質成分，在一定程度上具有抑制糖尿病腎間質纖維化的作用。結果見表1～3。

表1 各組HK-2細胞ColⅠ含量對比

表1 各組HK-2細胞ColⅠ含量對比

組 別24h48h空白對照組0．553±0．085#0．520±0．071#高糖誘導組1．921±0．051?2．187±0．107?空白血清對照組0．580±0．106#0．459±0．061?#新加糖腎康低濃度組1．617±0．118?1．481±0．088?#新加糖腎康中濃度組1．613±0．117?1．597±0．039?#新加糖腎康高濃度組1．606±0．123?#1．342±0．148?#

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與高糖誘導組對比，#P<0.05。

表2 各組HK-2細胞Col Ⅲ含量對比

表2 各組HK-2細胞Col Ⅲ含量對比

組 別24h48h空白對照組2．544±0．251#2．131±0．112#高糖誘導組4．533±0．331?6．026±0．216?空白血清對照組2．611±0．370#2．289±0．386#新加糖腎康低濃度組4．407±0．295?4．159±0．329?△新加糖腎康中濃度組3．943±0．126?#3．429±0．054?#新加糖腎康高濃度組3．397±0．247?#2．796±0．257?#

注：與空白對照組對比，*P<0.05；與高糖誘導組對比，#P<0.05。

表3 各組HK-2細胞FN 含量對比

表3 各組HK-2細胞FN 含量對比

組 別24h48h空白對照組467．711±58．318△487．362±66．507△高糖誘導組1193．438±13．330?1461．097±46．103?空白血清對照組414．180±97．499#457．547±71．237#新加糖腎康低濃度組1231．385±61．166?1050．461±63．972?#新加糖腎康中濃度組1141．940±120．904?1076．889±42．268?#新加糖腎康高濃度組1095．184±78．950?#1030．810±54．585?#

注：與空白對照組對比，﹡P<0.05；與高糖誘導組對比，#P<0.05。

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病的并發癥之一。現代醫學認為，糖尿病患者腎功能損害與腎小管間質病變的嚴重程度密切相關，其病理學特征為腎小管細胞外基質(extracellular matrixc，ECM)積聚、間質纖維化。研究發現：腎小管上皮細胞轉分化為間充質細胞是腎間質纖維化發生機制之一，一般情況下炎癥、損傷、細胞因子、高糖、終末糖基化產物均可誘導腎間質纖維化[5]。腎間質纖維化時ECM 主要由3 部分組成: ①膠原蛋白，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原等； ②非膠原糖蛋白，包括纖連蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、內皮粘連蛋白等; ③糖胺多糖與蛋白多糖，包括透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸角質素、肝素等[6]。本課題主要研究新加糖腎康對高糖誘導的腎間質纖維化ColⅠ、Col Ⅲ和FN的影響。

DN既屬“消渴”，又屬“腎病”范疇[3]。本病以消渴日久、纏綿不愈使臟腑功能失調，陰陽氣血虛衰而發病。究其病因病機，歷代醫家多重視腎虛血瘀，基本病機特點為本虛標實。本虛指陰虛、陽虛、氣虛、血虛、肝虛、心虛、脾虛、肺虛、腎虛；標實即痰濁、水濕、瘀血。本虛與標實互為因果，相互為病。如唐代孫思邈《千金要方》也認為消渴病的發病基礎是“盛壯之時，不自慎惜，快情縱欲，極意房中，稍至年長，腎氣虛竭，百病滋生”。《圣濟總錄》云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，水液凝聚體內而出現水腫。”新加糖腎康組方符合DN本虛標實的理論基礎，方中黃芪、生地黃益氣養陰，為君藥；槐米、大黃清熱祛濕，為臣藥；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，為佐藥。方中新增水蛭為蟲類藥，使組方的活血化瘀作用更強。

本研究結果顯示：與空白對照組對比，人腎小管上皮細胞在高糖刺激后，細胞外基質成分ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量上升，差別有統計學意義(P<0.05)，說明高糖可以導致細胞外基質成分增多，是糖尿病腎間質纖維化的主要因素。以新加糖腎康干預后，ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量開始下降，與單純高糖組對比，差別有統計學意義(P<0.05)，說明新加糖腎康在一定程度上能夠抑制高糖刺激的細胞外基質成分沉積，具有抑制糖尿病腎間質纖維化的作用。

[1]李能娟，李紅.腎小管上皮細胞表型轉化與糖尿病腎病[J].國際內分泌代謝雜志，2006，26(4)：277-279.

[2]張東鵬，張定華，王曉暉.糖腎康膠囊對早期糖尿病腎病患者血漿內皮素-1、尿微量白蛋白的影響[J].中華實用中西醫雜志，2010，23(3)：16-18.

[3]楊麗霞.劉銅華教授中醫診治糖尿病腎病的學術思想[J].國際中醫中藥雜志，2008，30(5)：385-386.

[4]凌光輝，唐文彬，孫林，等.Smad 錨著蛋白在高糖誘導人腎小管上皮細胞細胞外基質沉積中的作用[J].腎臟病與透析腎移植雜志, 2012,21(4):346-352.

[5]馬強，陳俊香，程慶礫，等.阿魏酸鈉對高糖誘導腎小管上皮細胞損傷的保護作用[J].華南國防醫學雜志，2013,27(6)：379-382.

[6]俞東容. 中藥抗腎間質纖維化機制研究[J]. 浙江中醫藥大學學報，2006，30(6)：694-695.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0056-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.28

薛建軍，副主任醫師，1144870599@qq.com

甘肅省中醫藥管理局中醫藥科學技術研究課題(GZK-2011-13)；北京中醫藥大學創新團隊項目(2011-CXTD-19)；國家自然科學基金面上項目(30973909)

2014-07-02；

2014-11-06