血凝抑制試驗易出現的問題與糾正方法

吳召坤/陜西省丹鳳縣畜牧獸醫中心

本人在獸醫實驗室工作十余年，最常做的就是血凝抑制試驗，血凝抑制試驗常用于雞新城疫、禽流感等疫病的抗體檢測與流行病學調查，疫病診斷、防疫監測、免疫程序的制定等工作中，該試驗要求操作規范，精心細致，取量精確，判定及時準確，在操作的過程中，稍有失誤，就會使試驗出現偏差，導致試驗失敗。本人通過長期的實際工作，總結經驗教訓，現將試驗過程中常出現的問題進行列舉，分析，提出糾正方法。

（一）在測定抗原血凝效價時，1～11孔全部百分之百凝集，判定不出抗原效價

原因：抗原效價高，超出血凝板測定范圍，解決辦法，將抗原做倍比稀釋2～3次再測即可。

（二）在測定抗原血凝效價或抗體抑制價時發現紅細胞即不被抗原凝集，又不被抗體抑制凝集，1～12孔全部為淡紅色

原因：紅細胞溶血。解決的辦法：重新配制1%的紅細胞，正常的1%紅細胞懸液靜置4～6h后，紅細胞沉于溶器底部，上清液清亮透明。

紅細胞發生溶血的原因有：

（1）紅細胞保存時間太長，超過使用期限。

（2）紅細胞懸液凍溶。

（3）PBS液配制不準確。

(三)標準陽性血清的抗體效價誤差大于1個滴度

原因1：4個血凝單位抗原配制不準確，4單位抗原要現用現配，混合均勻，配好的抗原室溫下放置不超過4h，不可反復凍融。為了防止4單位抗原配制不準確，在作血凝抑制試驗前必須作回歸試驗來測定4單位抗原是否準確。方法是：在血凝板的1～4排1～5孔各加0.025mlPBS 液，取配好的 4 單位抗原0.025ml加入反應板的第一孔內，混勻后吸取0.025ml加入第二孔，依次倍比稀釋至第4孔，從第4孔吸取0.025ml棄去，第5孔做對照，1 ～ 5 孔 各 加 0.025mlpbs液，1～5孔各加1%紅細胞懸液，震蕩混勻，20℃～25℃靜置40min后觀察結果，若1～2孔紅細胞完全凝集，3～4孔不凝集，則說明4單位抗原配制準確，否則需重新測定抗原效價，配制4單位抗原，并作回歸試驗。直至結果準確。

原因2：陽性對照血清效價降低，陽性對照血清經反復凍融，長期保存或保存不當，就會使抗體效價降低，因此，陽性對照血清不可反復凍融，若要長期保存必須保存在－15℃以下，不得超過保質期。

(四)結果出現慢

原因：環境溫度過低，如果環境溫度低于20℃時，結果就會出現慢，需延長時間才能出現結果，因此在作試驗時應將環境調到20℃～25℃。

(五)結果出現快，而且整板無凝集

當試驗環境溫度超過30℃時，反應速度加快，試驗結果出現快，往往在20min左右就可讀數，一旦時間過長，結果就會消失，使整板無凝集現象，會誤認為抗體滴度為10log2。因而要求試驗溫度應控制在20℃～25℃之間，反應40min及時讀數判定，不可長時間拖延讀數時間。

（六）整板無紅細胞凝集現象

當試驗環境溫度在20℃～25℃時，經40min，整板無凝集，整板無紅細胞凝集現象有以下四種可能：一是8份血清抗體滴度均為10log2，二是試驗過程中全板少了加4單位抗原步驟。三是4單位抗原已失效。四是環境溫度過高，反應速度加快，讀數時間拖延。

如果整板無紅細胞凝集現象時，首先要查明原因，方法是用微量移液器吸取每孔內的混懸液，當每孔內的混懸液容量為0.075ml時，可能是一、三、四項原因。當每孔內的混懸液容量為0.05ml時，可能是第二項原因。因而要對試驗過程仔細分析，查明原因。無論那種原因引起的全板無凝集現象，都必須重新檢測，如果是第三項原因引起的，要重新配制4單位抗原，注意操作過程中專心細致，隨時檢查操作過程是否漏掉了某些步驟，規范操作，控制好試驗過程中的環境溫度，及時判定結果。

（七）八份被檢樣品的抗體效價均為 1log2

原因1：可能8份被檢血清加后未進行倍比稀釋，這種情況一般發生在使用八通道移液器時遺漏了將被檢血清作倍比稀釋這一環節，第一孔由于抗體滴度高發生全部抑制凝集，而2～11孔無抗體，則完全凝集（第11孔為抗原對照孔）。原因查找：用微量移液器吸取第一孔混懸液，若容量為0.1ml，而2～10孔混懸液均為0.075ml，即為這一原因造成。

原因2:當排除原因1后，也可能8份被檢血清抗體效價均為1log2，這種情況很少發生。

在作試驗的過程中，一定要嚴格按照操作規程，規范操作，仔細專心，避免打岔干擾，從使用器具的清洗消毒到試劑的配制，以及試驗操作過程的每個步驟都要認真細致，不能馬虎，做到科學、認真、準確，才能把試驗做的更精確，無誤差，正確指導動物疫病防控工作。