PCR-線性雜交酶顯色法檢測結核分枝桿菌耐藥性效果分析

李大登，馬俊，魏小妹(江陵縣人民醫院，湖北江陵43400;武漢市醫療救治中心)

PCR-線性雜交酶顯色法檢測結核分枝桿菌耐藥性效果分析

李大登1，馬俊2，魏小妹1
(1江陵縣人民醫院，湖北江陵434100;2武漢市醫療救治中心)

摘要:目的探討PCR-線性雜交酶顯色法(以下稱顯色法)檢測結核分枝桿菌對異煙肼及利福平耐藥性的臨床價值。方法選擇結核病患者的臨床痰標本471份，其中結核分枝桿菌分離株120株(分離株)、痰涂陽性標本351份(痰涂標本)。采用顯色法對兩種標本行異煙肼及利福平耐藥性檢測，以傳統的比例法藥敏試驗作為金標準，比較兩種方法所用的檢測時間，分析顯色法檢測的靈敏性、特異性、陽性預測值及陰性預測值。結果顯色法對分離株及痰涂標本耐藥性的檢測時間均少于比例法(P＜0.01)。顯色法檢測分離株中異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽性預測值與陰性預測值分別為93.33%、100%、100%及97.83%，利福平分別為90.91%、100%、100%及98%;痰涂陽性標本中異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽性預測值與陰性預測值分別為83.33%、97.97%、88.24% 及97%，利福平分別為89.66%、97.27%、86.67及97.94。結論顯色法檢測結核分枝桿菌對異煙肼、利福平耐藥的靈敏性和特異性均較高，可在24 h內獲得檢測結果，是一種快速、可靠檢測結核分枝桿菌耐藥的方法。

關鍵詞:線性雜交酶顯色法;結核分枝桿菌;異煙肼;利福平;抗藥性

異煙肼及利福平是治療結核的一線藥物，結核分枝桿菌對其產生耐藥是影響結核病治療效果的主要原因［1］。傳統的藥物敏感試驗采用比例法檢測結核分枝桿菌的耐藥性，但檢測周期長，易延誤治療時間。PCR-線性雜交酶顯色法(GenoType?MTBDRplus法，以下稱顯色法)是一種快速、可靠的檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法［2，3］。2011年7月～2014年5月，我們采用顯色法檢測了肺結核患者痰標本中結核分枝桿菌對異煙肼及利福平的耐藥情況，探討該方法在結核分枝桿菌耐藥性檢測中的應用價值。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇同期就診于武漢市醫療救治中心的疑似肺結核病患者［男295例、女255例，年齡14～83(47±6.43)歲］的臨床痰標本471例份，其中結核分枝桿菌分離株(以下稱分離株) 120株，痰涂陽性(金銨“O”染色陽性)標本351例份(以下稱痰涂標本)。

1.2耐藥性檢測對所有標本分別采用顯色法及比例法藥敏試驗行異煙肼和利福平耐藥性檢測。

1.2.1顯色法嚴格按照操作手冊進行，主要分為4步:超聲波水浴破菌提取DNA、對模板進行PCR擴增、將擴增產物進行雜交顯色、結果判讀。如試紙條上所有的野生型條帶顯色而突變型條帶不顯色，則將該菌株判定為敏感株。如對應藥物的野生型條帶不顯色或突變型條帶顯色，則將該菌株判定為耐藥菌株。如試紙條上TUB質控帶為陰性，表示所試細菌不屬于結核分枝桿菌復合群，需排除。

1.2.2比例法嚴格按常規步驟操作，主要分為4 步:菌懸液制備、菌液稀釋、接種培養、報告結果。如耐藥百分比大于1%，則認為受試菌對該抗結核藥耐藥。

1.3檢測效果分析比較兩種方法所用的檢測時間。以比例法檢測結果為金標準，采用交叉列表對比法，分析顯色法檢測異煙肼及利福平耐藥性的檢測效果，靈敏性=(真耐藥數+假敏感數)/真耐藥數×100%，特異性=(真敏感數+假耐藥數)/真敏感數×100%，陽性預測值=(真耐藥數+假耐藥數)/真耐藥數×100%，陰性預測值=(真敏感數+假敏感數)/真敏感數×100%。

1.4統計學方法應用SPSS19.0軟件，計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1檢測時間顯色法對分離株與痰涂標本的檢測時間分別為(6.12±1.23)、(6.24±1.32) h，比例法分別為(2.12±0.64)、(4.03±2.13)個月，顯色法對分離株及痰涂標本耐藥性的檢測時間均少于比例法(P＜0.01)。

2.2分離株耐藥性顯色法檢測出對異煙肼耐藥28株、利福平耐藥20株，比例法分別為30、22株，顯色法檢測分離株對異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽性預測值及陰性預測值分別為93.33% (28/30)、100%(90/90)、100% (28/28)及97.83% (90/92)，利福平分別為90.91% (20/22)、100% (98/98)、100%(20/20)及98%(98/100)。

2.3痰涂標本耐藥性顯色法檢測出對異煙肼耐藥45例份、利福平耐藥52例份，比例法分別為54、58例份。顯色法檢測痰涂標本對異煙肼耐藥的靈敏性、特異性、陽性預測值及陰性預測值分別為83.33%(45/54)、97.97% (291/300)、88.24% (45/51)及97%(291/300)，利福平分別為89.66% (52/58)、97.27% (285/293 )、86.67% (52/60 )及97.94%(285/291)。

3　討論

目前，結核分枝桿菌耐藥性已成為導致結核病疫情上升及病情難以控制的一個重要原因［4～6］。異煙肼與利福平是一線抗結核治療的主要藥物，臨床應用較為普遍，因此兩藥的耐藥性較常見，耐藥率也較高［7～9］。研究發現，約30%的結核病患者對異煙肼與利福平耐藥，可能與臨床對以異煙肼及利福平為主的短程化療方案的過度濫用有關［10］。因此，為更好地應用異煙肼與利福平、降低結核分枝桿菌的耐藥性，應采用快速、有效的耐藥性檢測技術以早期發現耐藥性。

比例法是WHO推薦的藥敏試驗方法，是臨床判斷結核分枝桿菌是否耐藥的金標準。但該方法檢測步驟較多、檢測人員工作量大，且檢測時間長，一般需2～4個月，導致在檢測期間選擇臨床用藥時無法及時調整治療方案，可能延誤結核病的治療。顯色法是基于PCR-線性探針雜交原理檢測耐藥基因的檢測技術［11～14］，可通過檢測對利福平耐藥的rpoB基因和對異煙肼耐藥的katG、inhA基因是否突變判斷結核分枝桿菌的耐藥性，可在24 h內完成耐藥性檢測。采用顯色法可直接從涂陽痰標本及分離株中檢測耐藥基因，節省了分離培養的時間，使檢測結果的報告時間比比例法縮短了2～4周。本研究發現，顯色法6 h左右即可報告檢測結果，而比例法則需要2～4個月，表明顯色法可以更早地獲得耐藥性檢測結果，有利于臨床及時調整用藥。采用顯色法檢測分離株異煙肼、利福平耐藥性的靈敏性、特異性、陽性預測值與陰性預測值均較高，對痰涂標本檢測的靈敏性、特異性、陽性預測值與陰性預測值亦較高但均低于分離株。

綜上所述，顯色法檢測結核分枝桿菌對異煙肼、利福平耐藥的靈敏性和特異性均較高，可在24 h內獲得檢測結果，是檢測結核分枝桿菌耐藥性快速、有效的方法。

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(收稿日期:2014-10-20)

文章編號:1002-266X(2015) 18-0075-02

文獻標志碼:B

中圖分類號:R978.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.028