帕金森致病基因LRRK2的研究進展

劉崴，張本恕(天津醫科大學總醫院，天津300052)

帕金森致病基因LRRK2的研究進展

劉崴，張本恕
(天津醫科大學總醫院，天津300052)

摘要:帕金森病(PD)是繼阿爾茨海默病的第二大神經退行性疾病。隨著對PD發病機制的研究深入，發現遺傳因素在PD發病中起著越來越重要的作用。其中LRRK2不僅是常染色體顯性遺傳PD最常見的原因，且在散發PD發病中起重要作用。本文對LRRK2基因的基本特征、功能特點、各種突變形式及該基因致PD發病機制的研究進展進行綜述。

關鍵詞:帕金森病; LRRK2基因;基因突變

帕金森病(PD)是繼阿爾茨海默病的第二大神經退行性疾病。65歲以上人群中發病率高達1%。PD患者有運動和非運動癥狀，多巴胺治療僅提供短暫的緩解且不能減慢疾病的進展。14%的PD患者有家族史，一般認為PD是多基因病，由基因和環境相互作用所致。隨著對PD發病機制研究的深入，研究人員發現遺傳因素在PD發病中起著越來越重要的作用。目前發現與PD明確有關的致病基因有5個，分別是α-synuclein、Parkin、DJ-1、PINK1和LRRK2基因。其中LRRK2不僅是常染色體顯性遺傳PD最常見的原因，且在散發PD發病中起重要作用［1］。因此關于LRRK2基因的基本特征、功能特點、各種突變形式及其調控機制的研究逐漸成為熱點。現對該基因與PD的研究進展綜述如下。

1　LRRK2的結構與分布

LRRK2又名Park8，位于第12號染色體，p11.2～13.1，長約144 kb，編碼2 527個氨基酸，是大分子蛋白，相對分子質量286 kD，由高度保守的ROCO蛋白、富含亮氨酸重復序列(LRR)、Ras蛋白復合體(ROC)、Ras蛋白C-末端重復序列(COR)、MAPKKK結構域(即激酶結構域)和色氨酸(W)天冬氨酸(D)重復序列區(每個重復序列由40個色氨酸和天冬氨酸組成，又稱WD40區域)組成。LRR和WD40存在N-末端重復，提示具有類似支架蛋白的功能。LRR結構域主要調節蛋白質間的互相作用; ROC和COR結構域具備GTP酶活性，在Ras介導的細胞轉變、細胞破裂、黏著作用的組成及MAPK信號通道中起主要作用;激酶結構域與下游蛋白質的磷酸化有關; WD40區域是一個在進化上高度守舊的區域，主要參與蛋白質間的相互作用，可與多種蛋白可逆性結合，亦參與運輸和信號傳導過程［2］。

LRRK2不僅在中樞神經系統高度表達，在肺、腎和白細胞中表達更高，且LRRK2的表達隨著年齡增加而增加［3］。研究發現在嚙齒類動物腦部尾狀核、皮層的表達量很高，在黑質相對低一些。且LRRK2僅在神經細胞中表達，膠質細胞未發現其表達。這點與先前的mRNA研究一致。LRRK2mRNA除在尾狀核和皮層含量高以外，在嗅結節、伏隔核、海馬、小腦中亦存在，黑質中含量相對較低。最近研究人員又發現LRRK2蛋白在隔核、丘腦、下丘腦、乳頭體核、腦干和室下區表達顯著。LRRK2主要存在于多巴胺能投射區，最近的研究發現改變多巴胺傳送對紋狀體D2受體缺失顯著或黑質多巴胺能神經元缺失PD患者的LRRK2mRNA表達無效果;而對單胺能囊泡缺失小鼠LRRK2mRNA含量表達亦無效。有研究顯示，在經左旋多巴治療MPTP所致帕金森絨猿后誘發肌張力障礙后，腦中LRRK2mRNA含量增加［4］。關于多巴胺運輸改變對LRRK2蛋白的作用仍未知。LRRK2在許多非多巴胺區域表達提示其在細胞中存在某種基本功能。提示我們LRRK2功能損傷會導致特定的細胞易損性增加。

2　LRRK2　的定位

在許多細胞系轉染中，大部分LRRK2位于細胞質的不同部位，可能與線粒體相聯系。雖然LRRK2不包含任何的疏水穿膜結構或線粒體及核的靶序列，但亞細胞分級提示LRRK2在膜上和微粒體上。另外LRRK2被發現位于脂筏上即細胞膜和膜細胞器的的微結構域。如高爾基體、漿膜、突觸囊泡、線粒體和內質網。原代鼠細胞培養亦證實LRRK2位

于膜結構。在成年嚙齒類動物腦組織中亦發現LRRK2位于微粒體、突觸小泡和突觸細胞溶質等有膜結構［5］。LRRK2位于膜和膜器官上，很可能通過調節突觸小泡合成、運輸或調節膜結構來實現突觸調節功能［2］。

3　LRRK2　突變

LRRK2突變主要集中在該蛋白的中心區，包括ROCGTP酶結構域、MAPKKK結構域和COR結構域。ROCGTP酶結構域存在一個堿基位點，可出現多個突變(R1441C，R1441G，R1441H); COR結構域有一個突變(Y1699C);mAPKKK結構域有兩個相鄰的堿基突變(G2019S和I2020T)。相反在酶結構域外的突變目前用孟德爾遺傳方式還沒有證實無關。這些均提示酶的活動在疾病發病中起重要作用。體外研究顯示發生在RocGTP酶結構域和COR結構域的突變可降低GTP酶活性［6］。然而在體外研究中純化的全長LRRK2僅有微弱的GTP酶活性，提示在細胞內酶的活性需輔助蛋白。相反，MAPKKK結構域的G2019S突變可增加激酶活性［7］。研究表明G2019S是LRRK2最常見突變，6%～8%的家族型PD和1%～2%散發PD由其引起。WD40域的G2385R和COR結構域的R1628P突變對酶活性無影響。I2020T突變在部分模型中可促進4E結合蛋白(4EBp)磷酸化［8］，然而其他的檢測發現其對激酶活力無影響。因此相同區域的不同突變有著不同的作用機制，這可能是選擇的方法不同導致不同結果。以上數據表明LRRK2激酶和GTP酶活性在疾病發病機制中起重要作用。體內外實驗提示導致LRRK2激酶失活和GTP酶結合缺陷的突變較其野生型毒性要小。

大部分LRRK2蛋白存在可與其他蛋白結合的序列，因此LRRK2起著腳手架作用，對信號傳導有重要作用。研究人員已證實LRRK2完全或部分通過Roc域與集合的微管蛋白、蓬蛋白、CHIP共伴侶蛋白結合。有絲分裂素激活蛋白激酶(MAPPK)激酶6(MKK6)與COR激酶(調節細胞內相互作用)域結合。LRRK2是磷酸蛋白，通過富含亮氨酸重復序列的氨基末端位點與14-3-3蛋白家族相互作用可能解釋LRRK2的多種突變影響相同蛋白的原因。例如，ROC和COR區突變導致與14-3-3蛋白結合力下降，然而在激酶區G2019S突變卻沒有這種作用［9］。這提示該突變與其他突變發病機制不同。

4　LRRK2　功能

野生型LRRK2可調節神經元發育中的軸突生長，控制和維持軸突長度［10］;與Rab5a相互作用參與囊泡胞吞作用［11］;樹突和軸突之間的囊泡歸類［12］;與FADD相互作用激活凋亡［13］及通過4EBP1的磷酸化和與微小RNA(microRNA)通路相互作用控制蛋白翻譯來調節蛋白合成［14］。有研究報道LRRK2可與α和β微管蛋白相互作用，表明其還有維持細胞骨架動態作用［15］。潛在的LRRK2抑制劑H-1152可加強LRRK2在微管上附著，這表明二者的相互作用由激酶調控［16］。

LRRK2同時具有激酶域和GTP酶域，二者存在調節作用;其中ROC結構域具備GTPase激酶活性，屬于開關蛋白，通過與GTP聯結活化、水解失活間的轉變來調節LRRK2的激酶活性;提示ROC結構域是LRRK2發揮功能的調節中心，是潛在的藥物調節靶點，與臨床治療有密切聯系［17］。MAPKKK是信號轉導進程中的重要因子，屬于較大的酪氨酸激酶類蛋白亞族(MLKs)。GTP酶和MAPKKK參與多條信號傳導通道的上游調節，與部分蛋白質分子的磷酸化與去磷酸化相關，位于神經信號傳導級聯的上游，LRRK2基因該結構域的相關突變或許會擾亂這些信號的準確傳導，導致PD及其他神經退行性疾病的產生。

激酶域和GTP酶域可能通過二聚體的形式結合，許多蛋白酶和Ras-GTP酶均為二聚體。研究發現在人淋巴母細胞系中內源性LRRK呈聚合體形式。體外研究亦報道外源性LRRK2的聚合能力涉及多個結構域的互換。然而目前支持激酶域聚合的研究仍缺乏。ROC域能獨立發生作用或與LRRK2的中心結構ROC-COR-酶相互作用，這種作用可被WD40加強。ROC-ROC相互作用并不依賴核苷酸，但可被R1441C突變削弱。這表明LRRK2聚合體的不穩定可導致LRRK2GTP酶異常。LRRK2Ⅱ171Ⅴ突變可支持上述說法，但該突變是在年長的對照人群中發現的良性突變［18］。

最初的計算機模型提示LRRK2突變可以增加激酶活性。神經變性疾病大都存在異常的磷酸化且LRRK2突變可導致多樣的病理，因此以激酶活力作為基因治療的靶點不僅可用于PD亦可用于其他神經變性疾病。LRRK2Ras-GTP酶同Ras相關GTP酶家族序列同源，高度保守包括GTP結合和水解。Retromer LRRK2Ras-GTP酶在GTP結合體(激活)及GDP結合體(失活)之間轉換形成了一個環路。LRRK2Ras-GTP酶通過這兩種形式的轉換來調節不同的細胞信號傳導。這個過程由鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs)和GTP酶激活蛋白(GAPs)來輔助［6］。ROC突變可降低GTP酶活性表明該處突變可延長

LRRK2GTP酶的活性狀態。結晶結構顯示激活的GTP酶結構域有一個特有的折疊二聚體，ROC突變可打破這個三級結構，從而支持上述猜想［19］。LRRK2激酶的活性需要GTP酶來激活。結合非水解的GTP類似物可促進LRRK2的磷酸化，這表明LRRK2的激活可通過自己的GTP酶激活分子內的MAPKKK。R1441C/G突變可能通過延長RRK2GTP酶的活性狀態加強激酶活力。

LRRK2通過泛素—蛋白酶體途徑降解，而不是通過自噬—溶酶體途徑降解［20］，在體外實驗中過度表達LRRK2可引起蛋白聚集及神經退行性變。在HEK293細胞系中，轉染了LRRK2野生型及G2019S、Y1699C及R1441C的一部分細胞發生聚集。在神經節細胞SH-SY5Y細胞系中及在小鼠E15/16原代皮層細胞可以觀察到LRRK2野生型出現神經退變;然而在發生R1441C、G2019S、Y1699C突變的原代細胞培養中，退變顯著增加且伴隨細胞凋亡［21］。與上述結果一致，在Cos-7細胞中LRRK2包涵體的形成及凋亡細胞明顯增多。FADD和caspase-8是外源的細胞死亡途徑中的兩個關鍵蛋白，研究發現，LRRK2可與含有死亡結構域(DD)的FADD、TRADD、RIP1相互作用［22］。在原代培養的神經元中，抑制FADD的功能及使caspase-8表達沉默可阻礙LRRK2介導的細胞凋亡，提示FADD/ caspase-8信號途徑在LRRK2介導的神經元死亡中起重要作用。LRRK2PD突變體的激酶活性上升是導致神經元死亡的重要原因，提示控制LRRK2的激酶活性是治療PD的一種策略［23］。

5　LRRK2　突變致PD的發病機制

LRRK2突變相關的PD患者與其他典型的PD患者在臨床表現上無差別，其病理變化呈現出多樣性的特點，既可以有lewy小體，亦可以有Tau蛋白的聚集等。尸檢時發現部分患者的Lewy小體中LRRK2蛋白陽性，推測LRRK2在lewy小體的形成中可能通過與alpha synuclein蛋白相互作用產生病理變化。在攜帶有突變LRRK2蛋白的PD患者中會出現Tau蛋白陽性的神經纖維纏結樣病理改變。另外有的患者中既無Lewy小體，亦無神經纖維纏結。相對于alph synuclein蛋白主要出現于Lewy小體中，Tau蛋白主要出現在神經纖維纏結，而LRRK2蛋白的免疫細胞化學無特異的、神經變性的病理變化［23］。因此LRRK2突變可出現在PD、阿爾茨海默病(AD)、進行性核上性麻痹(PSP)和路易體癡呆。

α-突觸核蛋白(α-syn)是Lewy體的主要成分。由常染色體隱性遺傳PD的致病基因: Parkin、PINK1和DJ-1突變導致的PD神經元中缺乏Lewy小體(LBs)，提示其發病是由于線粒體功能受損所致。而α-突觸核蛋白(α-syn)和LRRK2是常染色體顯性遺傳PD的致病基因，一般有LB病理改變，α-syn是其主要成分。研究發現，不同的LRRK2突變導致不同的發病路徑。這可能是因為LRRK2作為信號蛋白，作用于α-突觸核蛋白和其他蛋白的上游，在神經變性病中，突變導致蛋白沉積在殘存神經元中［9］。

Lewy小體中的α-突觸核蛋白是高度磷酸化的，體外研究亦表明磷酸化的α-突觸核蛋白更易聚集，表明這種磷酸化的α-突觸核蛋白異常增多可誘發神經變性。LRRK2是激酶，可使α-突觸核蛋白磷酸化，但只有1項研究支持這個觀點，該項研究是在過度表達LRRK2的HEK293細胞裂解物中發現重組的α-突觸核蛋白直接磷酸化，而在細胞中及動物模型中均無α-突觸核蛋白證據支持上述觀點。有1項研究報道LRRK2可經細胞外信號調節的激酶通路調節α-突觸核蛋白表達，但作用不大［24］。Qing等［25］在不同病理組織的路易小體及遭受氧化應激的HEK293細胞上成功地免疫共沉淀LRRK2和α-突觸核蛋白。提示在應激情況下二者定位于相同的細胞器，參與共同的生物過程并且LRRK2可直接或間接影響α-突觸核蛋白的磷酸化狀態。

多項研究亦表明，α-突觸核蛋白以α螺旋結構與膜相互作用，而LRRK2亦與膜相互作用。二者均參與突觸囊泡回收及與脂筏相互作用。脂筏是膜微結構，用作細胞內信號傳導。這些結構需要特異的支架蛋白，而LRRK2具有支架蛋白功能，可通過蛋白—蛋白間相互作用結構域(WD40和LRR)調節異源性相互作用。突變可損傷LRRK2組織脂筏的能力，對α-突觸核蛋白與脂筏相互作用產生直接影響。LRRK2和α-突觸核蛋白在微管動態平衡和軸突運輸方面亦有聯系。很多研究已證實LRRK2可引起tau蛋白高度磷酸化從而打破微管平衡最終錯誤地運輸結合α-突觸核蛋白的囊泡使蛋白聚集，誘發細胞死亡。最后突變的LRRK2如R1441C，可削弱自體吞噬功能促進α-突觸核蛋白聚集［26］。

除了磷酸化外LRRK2還可通過其他機制加劇α-突觸核蛋白的毒性。LRRK2表達導致微管動態平衡、高爾基體和線粒體受損。敲除LRRK2可減輕這些表現。雖然這些數據建立了LRRK2和α-突觸核蛋白的聯系，但是否也發生在中腦的多巴胺能神經元中仍不得而知，有待進一步研究。

綜上所述，LRRK2作為神經細胞內高表達的

一種蛋白，可能作為一種激酶，參與細胞內多種途徑的信號轉導，病理條件下可能參與α-突觸核蛋白及Tau蛋白的磷酸化和聚集。其激酶的特異性底物和上下游通路及各種突變對它們的影響有待進一步研究。

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收稿日期:( 2015-04-07)

文章編號:1002-266X(2015)33-0094-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R745

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.038