銀屑病患者病灶組織、血清中抗菌肽LL-37表達變化及意義

種樹彬，蘭海梅，曾抗，趙學峰(南方醫科大學附屬南海醫院，廣東佛山5800;南方醫科大學南方醫院)

銀屑病患者病灶組織、血清中抗菌肽LL-37表達變化及意義

種樹彬1，蘭海梅2，曾抗2，趙學峰1
(1南方醫科大學附屬南海醫院，廣東佛山528200;2南方醫科大學南方醫院)

摘要:目的探討銀屑病患者病灶組織與血清中抗菌肽LL-37表達變化及其意義。方法收集45例尋常型銀屑病患者(觀察組)和44例健康人群(健康對照組)的血清，另選取25例尋常型銀屑病患者的病灶組織(試驗組)和25例因創傷需自體手術植皮患者的正常皮膚組織(對照組)。血清LL-37水平檢測采用ELISA法。銀屑病病情嚴重程度采用PASI評分法判定，分析血清LL-37水平與銀屑病病情嚴重程度及炎癥因子IL-22和IFN-γ的相關性。采用Western blotting免疫印跡法和RT-PCR法檢測病灶組織中LL-37蛋白及mRNA表達。結果觀察組與健康對照組血清LL-37水平分別為12.3、9.43 ng/mL，兩組比較，P＜0.01。觀察組PASI得分平均13.7分。觀察組與健康對照組血清LL-37水平與銀屑病病情嚴重程度呈正相關(r =0.515，P＜0.001)。試驗組LL-37mRNA表達約為對照組的5.1倍，LL-37蛋白表達約為對照組的5.3倍，兩組LL-37mRNA及蛋白表達比較，P均＜0.01。結論銀屑病患者病灶組織及血清中抗菌肽LL-37表達均顯著升高，檢測抗菌肽LL-37有助于評判銀屑病病情嚴重程度。

關鍵詞:銀屑病;抗菌肽LL-37; PASI指數

銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，易反復發作。皮損的主要病理學變化是角化不全、炎癥細胞浸潤、血管異常增生［1］。其發病原因尚未完全明確，目前認為免疫系統紊亂起到一定作用，而炎癥細胞功能改變是銀屑病的潛在病因［2］。研究［3］表明由炎癥細胞產生的諸多炎癥因子在銀屑病發病和進展中起重要作用。抗菌肽LL-37是Catheliecidin家族抗菌肽蛋白N端的37個氨基酸，因其開始的氨基酸分別為L-L而得名。最近研究發現樹突狀細胞及抗菌肽LL-37在銀屑病的進展中有重要作用。抗菌肽LL-37具有廣譜的抗微生物活性及調節免疫系統、促進損傷修復、抗腫瘤等功能［4］。2013年4月～2014年9月，我們觀察了銀屑病患者病灶組織、血清中LL-37表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料25例尋常型銀屑病進展期患者［男12例、女13例，年齡(29.7±5.2)歲，BMI為(22.4±1.8)kg/m2］的病灶組織(試驗組)和25例［男11例、女14例，年齡(29.9±4.9)歲，BMI為(23.1±1.6)kg/m2］因創傷需自體手術植皮患者的正常皮膚組織(對照組)用于組織學研究，兩組年齡、性別、BMI具有可比性。均未接受口服藥物治療2周及外用藥物治療1周以上。排除標準:哺乳期患者、其它自身免疫性疾病、惡性腫瘤、糖尿病、肝腎功能不全、濕疹等其他皮膚病除外。將兩組皮膚組織分別進行組織切割，獲得真皮層及角質層皮膚樣本，提取皮膚組織蛋白，立即置于RNAlater液低溫保存。獲取組織前患者均簽署知情同意書并經醫院倫理委員會同意。另選取進展期銀屑病患者45例［男27例、女18例，年齡(31.8±7.4)歲，BMI(23.6 ±2.6)kg/m2］作為觀察組。入選標準和排除標準同上。健康對照組選擇同一時間查體健康者44例［男27例、女17例，年齡(30.9±8.1)歲，BMI(22.9 ±2.9)kg/m2］。空腹抽取兩組上肢靜脈血5mL，經EDTA抗凝，－80℃冰箱存放待測。

1.2血清LL-37檢測分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔，采用ELISA法檢測血清LL-37。操作按人LL-37、IL-22和IFN-γ試劑盒說明進行，每孔各加入稀釋PBS緩沖液稀釋1 000倍的待測血清10 μL，在37℃環境下溫育30min;洗板5次，加入酶標試劑50 μL，混勻，37℃環境繼續溫育30min，洗板后加入顯色劑避光顯色10min。在450 nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值)。根據標準品的濃度及對應OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.3病灶組織中LL-37蛋白檢測采用Western blotting法。將試驗組和對照組皮膚組織剪切成小

塊，加入適量的冰冷PBS均漿，靜置5min，棄沉淀，小心吸取上清轉移至另一離心管中;按常規操作步驟提取蛋白，盡快將上清轉入一預冷的潔凈微量離心管，即得核蛋白;上述提取的胞漿蛋白和核蛋白進行蛋白定量(Braford法或BCA法)，分裝并保存于－80℃，避免反復凍融。然后進行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。5%脫脂奶粉封閉后分別與抗β-actin(1∶1 000)、抗LL-37(1∶500)進行反應。取相同體積的A、B試劑，在保鮮膜上將其充分混勻; 1min后，將膜蛋白面朝下放置，并與A、B混合液進行接觸; 1min后移開膜并將其置于另一保鮮膜上，將膜上殘存的混合液去掉，再將其充分包好后放入X-光片夾中。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的相對分子質量和凈光密度值。

1.4病灶組織中LL-37mRNA檢測總RNA的提取及逆轉錄從樣本保存液中取出，根據RNA提取試劑盒上的操作步驟進行。RT-PCR反應。反應條件為95℃、3 s，95℃、5 s，60℃、34 s，循環40次。每標本檢測2次。根據最終的優化體系，比較目的基因與內標基因擴增效率的斜率回歸有無顯著性差異。每次實驗均重復3次以上。

1.5血清LL-37與銀屑病病情嚴重程度的相關性

銀屑病病情嚴重程度判定:采用PASI評分法［9］對銀屑病皮疹面積和嚴重程度進行評分。采用Spearman相關性分析法分析血清LL-37與銀屑病病情程度的關系。

1.6統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗法進行各組數據間的比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1觀察組與健康對照組血清LL-37水平比較

觀察組與健康對照組血清LL-37水平分別為12.3(9.33～17.10)、9.43(7.16～11.11)ng/mL，兩組比較，P＜0.01。

2.2試驗組與對照組LL-37表達比較試驗組LL-37mRNA表達約為對照組的5.1倍，LL-37蛋白表達約為對照組的5.3倍，兩組LL-37mRNA及蛋白表達比較，P均＜0.01。

2.3血清LL-37與銀屑病病情嚴重程度的相關性

觀察組PASI得分平均13.7分(1.98～29.81)。血清LL-37水平與銀屑病病情嚴重程度呈正相關(r =0.515，P＜0.001)。

3　討論

LL-37主要表達于骨髓源性細胞、組織上皮細胞、角質形成細胞及某些腺體等易與微生物接觸的部位［6］。LL-37在正常人體皮膚上一般不表達或低表達，當皮膚受到外來刺激(外傷、感染、炎癥等)時，LL-37表達水平即大大升高［7］。這些升高的LL-37來源包括角質形成細胞和趨化到局部的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等。作為天然免疫的重要成分，LL-37在機體遭受外來感染源侵犯時可與其他抗菌肽一同迅速而有效地提供第一線防御［8］。研究［9］表明，LL-37不但可直接殺滅感染源，還可間接參與獲得性免疫中免疫細胞的趨化、細胞因子釋放及部分炎癥性疾病的發生發展。

銀屑病是一種炎癥性皮膚病，其中Th1和Th17細胞及眾多細胞因子在其發病中起到重要作用。銀屑病皮損處角質形成細胞能分泌一系列趨化中性粒細胞和Th1細胞的細胞因子，這些細胞因子與IFN-γ等可調節白細胞和淋巴細胞中LL-37的轉錄和分泌。PASI指數是臨床評價銀屑病臨床療效的常用量表，具有較高的可靠性和實用性。本研究發現，抗菌肽LL-37在局部皮損和血清中的表達均顯著性升高，且血清LL-37水平與PASI指數呈明顯正相關性。說明LL-37在銀屑病發病和進展中發揮重要作用，血清LL-37可作為評價銀屑病進展的血清學指標。

參考文獻:

［1］滿孝勇，鄭敏.銀屑病發病機制的研究進展［J］.浙江大學學報(醫學版)，2006，35(6): 673-677.

［2］林景榮，劉曉明.銀屑病中T細胞活化與端粒酶表達的研究進展［J］.中國麻風皮膚病雜志，2006，22(12): 1006-1008.

［3］陳慰峰.醫學免疫學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2001: 147-149.

［4］Zaioum，Nizet V，Gallo RL.Antimicrobial and protease inhibitory functions of the human cathelicidin(hCAP18/ LL-37)prosequence［J］.J Investdermatol，2003，120(5): 810-816.

［5］He L，Jin Z，Liu F.Elevated serum levels of interleukin 21 are associated withdisease severity in patients with psoriasis［J］.Br Jdermatol，2012，167(2): 191-193.

［6］Conner K，Nern K，Rudisill J，et al.The antimicrobial peptide LL-37 is exp ressed by keratinocytes in condyloma acuminatum and verruca vulgaris［J］.J Am Acaddermatol，2002，47(3): 347-350.

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［8］Scot tmG，DavidsondJ，GoldmR，et al.The human antimicrobial peptide LL-37 is amultifunctionalmodulator of innate immune responses［J］.J Immunol，2002，169(7): 3883-3891.

［9］李方舟，胡海峰.人cathelicidin抗菌肽LL-37在宿主防御系統中的作用［J］.世界臨床藥物，2011，32(4): 243-246.

收稿日期:( 2015-05-10)

文章編號:1002-266X(2015)33-0087-02

文獻標志碼:B

中圖分類號:R758.63

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.035