糖尿病腎臟疾病患者外周血單核細胞TLR4基因表達及其與炎性因子的關系

周蒨，董萍，李晗，毛維維，韓冬梅，鞏偉偉，馮波(1同濟大學醫學院，上海0009;上海市第一康復醫院;同濟大學附屬東方醫院)

糖尿病腎臟疾病患者外周血單核細胞TLR4基因表達及其與炎性因子的關系

周蒨1，2，董萍2，李晗2，毛維維2，韓冬梅2，鞏偉偉2，馮波3
(1同濟大學醫學院，上海200092;2上海市第一康復醫院;3同濟大學附屬東方醫院)

摘要:目的觀察糖尿病腎臟疾病(DKD)患者外周血單核細胞Toll樣受體4(TLR4)基因表達變化，分析其與相關炎性因子的關系。方法選擇2型糖尿病(T2DM)患者149例(T2DM組)，其中單純糖尿病(SDM) 46例、早期DKD(EDN) 58例、臨床DKD(CDN) 45例;另選35例體檢健康者作為對照組。RT-PCR法檢測外周血單核細胞TLR4 mRNA，常規檢測血清白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)。結果與對照組比較，T2DM組外周血單核細胞TLR4 mRNA及血清CRP、IL-8、TNF-α均升高(P均＜0.05) ;與SDM比較，EDN、CDN患者TLR4 mRNA及血清CRP均升高(P均＜0.05) ;與EDN比較，CDN患者TLR4 mRNA及血清TNF-α、IL-8、CRP升高(P均＜0.05)。外周血單核細胞TLR4 mRNA的表達與血清TNF-α、IL-8、CRP均呈正相關(r分別為0.653、0.648、0.697，P均＜0.05)。結論DKD患者外周血單核細胞TLR4 mRNA表達增加，且與炎性因子密切相關，共同參與DKD的發生、發展。

關鍵詞:糖尿病并發癥;慢性腎臟疾病; Toll樣受體4;白細胞介素;腫瘤壞死因子; C反應蛋白

目前，糖尿病腎臟疾病(DKD)是終末腎臟疾病的首位病因［1］。DKD的發病機制至今尚未完全闡明，現已證實與白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)等炎性因子有關［2，3］。Toll樣受體4(TLR4)作為介導炎癥反應的主要受體，可促進細胞因子的合成和釋放，啟動炎癥反應［4］。2010年1月～2014年6月，我們觀察了DKD患者外周血單核細胞TLR4 mRNA的表達情況，并分析其與相關炎性因子的關系。現報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇在上海第一康復醫院內分泌科住院的T2DM患者149例(T2DM組)，均符合1999年WHO制定的糖尿病診斷標準［5］，排除合并原發性腎小球疾病、心腦血管、肝臟疾病或其他原因所致腎臟疾病。其中，男81例、女68例;年齡46～74(52.8±7.6)歲，病程2～16(9.2±3.1) a。根據24 h尿蛋白排泄率(UAER)行Mogensen分期［6］，單純糖尿病(SDM) 46例，早期DKD(EDN) 58例，臨床DKD(CDN) 45例。另選體檢健康者35例作為對照組，男19例、女16例;年齡40～75(53.6± 4.7)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2方法

1.2.1外周血單核細胞TLR4 mRNA檢測方法取3 mL靜脈血，采用Ficoll密度梯度離心法處理后提取單個核細胞。加入脂多糖1 μg/mL，置于DMEM完全培養基中，5% CO2、37℃培養6 h。取培養后的細胞懸液1 mL，采用TRIzol一步法提取總mRNA;逆轉錄成cDNA，用熒光定量PCR法測定TLR mRNA。反應條件: 94℃預變性5 min后，94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，循環30次; 72℃延伸5 min，4℃5 min。引物由大連寶生物公司設計并合成，上游引物5'-GGTGGAAGTTGAACGAAT-3'，下游引物5'-AGATGATACCGCACGAC-3'。取PCR產物置于2%瓊脂糖凝膠中，120 V電壓電泳30 min，拍照。計算β-acttin與TLR4的光密度比值，以此作為TLR4 mRNA的相對表達量。

1.2.2炎性指標檢測方法取空腹肘靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中;以3 000 r/min離心10 min，分離血清備用。采用德國Bayer公司的全自動生化分析儀檢測CRP，采用ELISA法檢測IL-8、TNF-α。

1.2.3統計學方法采用SAS8.2統計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用方差分析;相關關系采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA及血清 CRP、IL-8、TNF-α比較見表1。

表1　兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA及血清CRP、IL-8、TNF-α比較(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05;與SDM患者比較，bP＜0.05;與EDM患者比較，cP＜0.05。

組別　n　TLR4 mRNA　TNF-α(ng/mL)　IL-8(ng/mL)　CRP(g/L) T2DM 組SDM　46　0.41±0.14a　14.48±4.17a　11.91±2.04a　2.83±1.34aEDN　58　0.62±0.23ab　15.82±5.39a　12.13±2.58a　3.74±1.87abCDN　45　0.75±0.15abc　21.46±7.68abc　15.53±4.07abc　6.81±3.38abc對照組35　0.29±0.05　9.38±1.34　5.81±0.76　1.47±0.53

2.2外周血單核細胞TLR4 mRNA與血清CRP、IL-8、TNF-α的關系外周血單核細胞TLR4 mRNA的表達與血清TNF-α、IL-8、CRP均呈正相關(r分別為0.653、0.648、0.697，P均＜0.05)。

3　討論

臨床發現，控制血糖、血壓、尿蛋白及阻斷RAS系統等，僅對DKD有一定延緩作用，無法阻止其進展為終末期腎衰竭［7］。近年來，研究表明炎癥反應可作為胰島素抵抗綜合征參與T2DM并發癥的發生［8］。Wada等［9］研究認為，持續性低濃度炎癥反應與細胞外基質的累積是DKD進展的共同通路，闡明炎癥分子作用機制有望成為DKD新治療靶點。

TLR4作為具有跨膜信號轉導功能的膜結合受體，對激活固有免疫及適應性免疫反應有主導作用，可介導細菌內毒素誘導的炎癥反應，促進炎性因子的合成與釋放［10］。腎臟局部的炎癥反應可誘導外源性的淋巴細胞、單核/巨噬細胞趨化、聚集，進一步加劇腎臟的炎性損傷，而這些細胞中均有高水平的TLR4表達［11］。本研究結果顯示，T2DM組外周血單核細胞TLR4 mRNA及血清CRP、IL-8、TNF-α均升高，且隨著病情的加重TLR4 mRNA逐漸增加，說明TLR4表達水平與DKD的病情呈正相關，且對病情的敏感性高于炎性因子指標，也提示TLR4及其信號傳導通路可能在DKD的發病中起到重要作用。相關性分析顯示，外周血單核細胞TLR4 mRNA表達與血清TNF-α、IL-8、CRP均呈正相關。其可能的機制是多種內(外)源性的炎性因子依賴TLR4發揮作用，TLR4通過增加炎性因子產生分泌介導腎臟炎性損傷［12，13］。Kaur等［14］研究發現，TLR4基因缺陷小鼠的UAER及腎功能明顯改善，抑制DKD的進展，且這一作用獨立于血糖水平。Cha等［15］利用TLR信號通路抑制劑GIT27研究其對DKD小鼠模型腎臟保護作用，發現GIT27可降低促炎癥細胞因子的合成，改善氧化應激，減輕腎小球硬化，降低UAER。因此，干預TLR4信號通路激活可能有助于控制DKD的病情，但阻斷TLR信號通路能否成為DN治療的靶點尚需進一步研究證實。

參考文獻:

［1］Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12 ) : 1090-1101.

［2］Arora MK，Singh UK.Molecular mechanisms in the pathogenesis of diabetic nephropathy: an update［J］.Vascul Pharmacol，2013，58(4) : 259-271.

［3］Rivero A，Mora C，Muros M，et al.Pathogenic perspectives for the role of inflammation in diabetic nephropathy［J］.Clin Sci(Lond)，2009，116(6) : 479-492.

［4］Kruger B，Krick S，Dhillon N，et al.Toll-like receptor 4 contributes to ischemia and reperfusion injury following human kidney transplantation［J］.Proc Natl Acad Sci，2009，106(9 ) : 3390-2295.

［5］錢榮立.糖尿病臨床指南［M］.北京:北京醫科大學出版社，2001: 7-12.

［6］Mogensen CE.Microalbuminuria as a predictor of clinical diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，1987，31(2) : 673-89.

［7］van Buren PN，Toto R.Current update in the management of diabetic nephropathy［J］.Curr Diabetes Rev，2013，9(1) : 62-77.

［8］Lin M，Yiu WH，Wu HJ，et al.Toll-like receptor 4 promotes tubular inflammation in diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23(1) : 86-102.

［9］Wada J，Makino H.Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Clin Sci，2013，124(3) : 139-152.

［10］李宇涵，張紅，陸衛平.Toll樣受體4與糖尿病腎病的關系研究進展［J］.山東醫藥，2013，53(46) : 97-99.

［11］Gluba A，Banach M，Hannam S，et al.The role of Toll-like receptors in renal diseases［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6(4) : 224-235.

［12］Lepenies J，Eardley KS，Kienitz T，et al.Renal TLR4 mRNA expression correlates with inflammatory marker MCP-1 and profibrotic molecule TGF-beta(1) in patients with chronic kidney disease ［J］.Nephron Clin Pract，2011，119(2) : 97-104.

［13］Takata S，Sawa Y，Uchiyama T，et al.Expression of Toll-Like Receptor 4 in Glomerular Endothelial Cells under Diabetic Conditions ［J］.Acta Histochem Cytochem，2013，46(1) : 35-42.

［14］Kaur H，Chien A，Jialal I.Hyperglycemia induces Toll like receptor 4 expression and activity in mouse mesangial cells: relevance to diabetic nephropathy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2012，303(8) : 1145-1150.

［15］Cha JJ，Hyun YY，Lee MH，et al.Renal protective effects of tolllike receptor 4 signaling blockade in type 2 diabetic mice［J］.Endocrinology，2013，154(6) : 2144-2155.

(收稿日期:2014-12-04)

通信作者:馮波，E-mail: fengbo@ medmail.com.cn

文章編號:1002-266X(2015) 20-0083-02

文獻標志碼:B

中圖分類號:R587.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.034