大鼠腦動脈瘤形成過程中MMP-2、MMP-9動態變化及多西環素對其的抑制作用

付強，呂濤，關俊宏

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

多項研究證實，基質金屬蛋白酶(MMPs)活性異常增加參與了腦動脈瘤的形成，其中MMP-2和MMP-9倍受關注［1～3］。2011年2月 ～2012年5月，我們應用大鼠腎性高血壓模型，通過RT-PCR和免疫組化兩種方法，在基因和蛋白水平動態觀察大鼠腦動脈瘤形成過程中MMP-2及MMP-9的表達變化，闡明其在腦動脈瘤形成過程中的作用;同時，應用MMPs抑制劑多西環素干預腎性高血壓大鼠，通過抑制大鼠腦動脈瘤形成過程中異常增高的MMPs表達來阻止或延緩動脈瘤的發生、發展。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠90只，體質量200～250 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心提供。抗大鼠MMP-2單克隆抗體、抗大鼠MMP-9多克隆抗體、DNA marker(TIANGEN公司)，PCR儀(BIOER公司)，其他試劑為國產分析純;引物序列合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 將90只大鼠隨機分成對照組(n=10)、模型組(n=40)和治療組(n=40)。模型組和治療組腹腔注射10%水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉后，經背肋緣下縱切口，用絲線結扎雙側腎動脈后支;術后1周用絲線結扎左側頸總動脈，1%鹽水代替飲水，建立大鼠腎性高血壓模型。治療組予以多西環素(1.5 mg/kg)混入飼料喂養;模型組僅給普通飼料;對照組模擬手術，普通飼料喂養。

1.2.2 腦動脈瘤形成及動脈壁病理觀察 所有動物分別于術后 1、2、3 周及 1、2、3、4 個月處死，顯微鏡下仔細觀察顱底右側動脈環及其主要分支并將其剝離，光鏡下觀察動脈瘤形成情況及動脈壁病理變化。

1.2.3 腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白檢測 采用免疫組化染色。脫蠟和水化腦動脈壁組織切片，依據一抗要求預處理;3%甲醇—過氧化氫室溫去離子水孵育10 min，阻斷過氧化物酶活性;滴加一抗MMP-2、MMP-9(1∶50稀釋)，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗5 min×3次;滴加二抗IgG工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB溶液顯色，自來水沖洗。常規復染、脫水、透明、封片。陰性對照用 PBS來替代一抗，其余同上。

1.2.4 腦動脈壁MMP-2、MMP-9基因檢測 RTPCR法檢測MMP-2、MMP-9 mRNA在腦動脈中的表達。TRIzol一步法提取腦動脈總RNA，紫外分光儀測定RNA含量。采用TIANGEN成套試劑盒，β-actin作內參，自行設計引物。MMP-2正義序列為5＇-GGAAGCATCAAATCGGACTG-3＇，反義序列為 5＇-GGATACGGTCAGCACCTTTC-3＇;MMP-9 正義序列為5＇-GAATCACGGAGGAAGCCAAT-3＇，反義序列為 5＇-TAGCCCCAACTTATCCAGACT-3＇;β-actin 正義序列為 5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3＇，反義序列為5＇-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3＇。RT-PCR反應:取2 μg總RNA加入50 μL反應體系中，循環參數RT:42℃，50 min;PCR:95℃預變性5 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，經30個循環擴增后72℃延伸5 min。取10 μL PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析儀進行條帶灰度掃描，結果以目的基因與β-actin灰度比值表示。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。所有數據采用±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦動脈瘤形成及動脈壁病理改變比較模型組中11只可見動脈瘤形成，主要位于右大腦前動脈—嗅動脈分叉部;動脈壁表現為內膜墊、內彈力膜完全消失，外膜增厚，成纖維細胞增生，肌層平滑肌消失，血管壁呈動脈瘤樣擴張(插頁Ⅳ圖12);其余大鼠有不同程度動脈瘤樣改變。治療組僅有6只于右側顱底動脈環前半動脈分叉部可見動脈壁輕度隆起，余大鼠無動脈瘤樣改變。對照組大鼠右側顱底動脈分叉部無上述改變。

2.3 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白表達比較見表1。模型組陽性顆粒主要位于內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞質，MMP-2、MMP-9則表達在胞質，呈棕黃色染色。動脈各段陽性顆粒分布不均勻，在動脈瘤樣改變處分布更為密集(插頁Ⅳ圖13)。治療組腦動脈壁MMP-2及MMP-9表達被抑制，其中MMP-9的抑制更為顯著。隨著時間推移，MMP-2及MMP-9表達僅有輕度增加，無高峰期出現(插頁Ⅳ圖14)。對照組大鼠腦動脈壁MMP-2及MMP-9僅少量表達(插頁Ⅴ圖15)。

2.4 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9基因比較 見圖1、圖 2。

3 討論

表1 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白表達比較(%，±s)

表1 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白表達比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01。

組別 n MMP-2 MMP-9對照組10 5.58±0.62 4.79±0.58模型組 40術后1個月 13.12±1.59* 46.25±2.88*術后2個月 14.12±2.25* 48.77±2.65*術后3個月 15.02±1.23* 49.88±2.53*術后4個月 14.98±1.36* 50.05±2.14*治療組 40術后1個月 7.11±0.67△ 8.35±0.63△術后2個月 7.27±0.62△ 8.98±0.67△術后3個月 7.88±0.64△ 8.83±0.54△術后4個月 7.33±0.69△ 8.57±0.51△

圖1 各組腦動脈壁MMP-2基因比較

圖2 各組腦動脈壁MMP-9基因比較

腦動脈瘤在人群中的發病率達1% ～3%，動脈瘤破裂出血常致患者傷殘，甚至死亡，預后一般較差。開顱手術及血管介入治療是現有的兩種有效治療手段，但兩種方式均為有創性的操作，存在不同程度的手術風險及治療局限性。學者們期望通過研究腦動脈瘤的發病機制，應用基因及藥物等手段，從病因學角度對腦動脈瘤進行相關治療，從而達到預防或控制腦動脈瘤生長，降低其發病率及改善預后的目的。

圖12 模型組動脈瘤前期（HE染色，×400）

圖13 模型組MMP-2、MMP-9蛋白表達（免疫組化法，×400）

圖14 治療組MMP-2、MMP-9蛋白表達（免疫組化法，×400）

圖15 對照組MMP-2、MMP-9蛋白表達（免疫組化法，×400）

MMPs是一組破壞細胞外基質的鋅和鈣依賴性的蛋白溶解酶，可以降解細胞外基質中的膠原蛋白、非膠原糖蛋白和彈力蛋白，參與細胞外基質重構，其中MMP-2、MMP-9與腦動脈瘤形成關系最為密切。近期研究［4］顯示，四環素類抗生素是潛在基質金屬蛋白酶抑制劑，其除抑制細菌蛋白合成而達到抗菌作用外，還是一種能影響細胞多種功能的藥物。多西環素就是一種化學修飾四環素類抗生素，已被用來降低主動脈瘤［5］、牙周疾病［6］、關節炎等疾病的組織分解，以及減少腫瘤細胞的浸潤、轉移及血管的生成。

本研究應用免疫組化及RT-PCR法，系統動態觀察大鼠腦動脈瘤形成過程中MMP-2及MMP-9表達的變化。結果表明，在大鼠腎性高血壓形成早期，隨血壓升高，MMP-2、MMP-9表達開始升高;在腎性高血壓后期，隨血壓不斷升高，MMP-2、MMP-9表達維持在高水平狀態，MMP-9較MMP-2表達水平更高;同時，我們應用安全有效劑量的多西環素來干預腎性高血壓大鼠作為治療組，與模型組對比，發現多西環素能顯著抑制大鼠腦動脈瘤形成過程中增高的MMP-2、MMP-9，從而降低大鼠腦動脈瘤發生率。本實驗結果表明，在大鼠腦動脈瘤形成過程中，動脈壁經歷了由完整到逐漸被破壞、最終完全喪失正常層狀結構，成為動脈瘤壁的變化過程。MMP-2、MMP-9表達的異常升高破壞了大鼠腦動脈壁彈力蛋白，導致維持腦動脈壁韌性的主要結構內彈力膜斷裂、消失，此結果與文獻報道［7～11］相一致。同時，我們發現MMP-9異常表達較MMP-2更為明顯，為將來尋找有效抑制劑防治腦動脈瘤提供了參考靶點。

大量文獻已經證明，多西環素易透過血腦屏障，具有長期用藥耐受性高、不良反應小且使用方便、安全、經濟等優點。所以，多西環素作為一種神經保護劑，在腦動脈瘤形成過程中可以起到降低疾病發生率的作用，但對于已形成的腦動脈瘤是否具有治療作用，還有待進一步研究證實。

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