miR-200c基因重組慢病毒載體質粒構建及其人結腸癌多藥耐藥動物模型的建立

劉沖，隋華，朱惠蓉，李冬，李琦(同濟大學附屬同濟醫院，上海00065;上海中醫藥大學附屬曙光醫院)

miR-200c基因重組慢病毒載體質粒構建及其人結腸癌多藥耐藥動物模型的建立

劉沖1，隋華2，朱惠蓉2，李冬1，李琦2
(1同濟大學附屬同濟醫院，上海200065;2上海中醫藥大學附屬曙光醫院)

摘要:目的構建共同表達人miR-200c基因和熒光素酶基因的慢病毒(Lentivious)表達載體質粒，實現該重組體在人結腸癌多藥耐藥細胞中的穩定整合以及動物模型的建立，為進一步研究miR-200c調控大腸癌多藥耐藥提供實驗基礎。方法將miR-200c基因克隆至慢病毒pGC-Lentivirus表達載體中，測序鑒定后，包裝重組慢病毒表達質粒，并進行滴度測試。利用細胞轉染技術，將攜帶miR-200c過表達的慢病毒載體質粒轉染到人結腸癌多藥耐藥細胞株HCT-116/L-OHP中，并接種于裸鼠皮下，以空病毒載體作為對照。待腫瘤生長2周后，隨機分為4組，分別給予生理鹽水和奧沙利鉑(L-OHP)，4周后處死裸鼠，剝取腫瘤，測量腫瘤體積。結果病毒滴度測試最佳滴度為2×108TU/mL。qPCR結果顯示，轉染miR-200c-Lentivirus病毒質粒的人結腸癌耐藥細胞中miR-200c表達高于轉染空載體組以及空白對照組，P均＜0.01。活體成像觀察證實，帶有熒光素酶的HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc細胞在動物體內可被快速而靈敏的檢測到，可以準確地觀察腫瘤的生長情況。與HCT-116/L-OHP-luc組相比，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc組對L-OHP的敏感性更強，P＜0.05。結論成功構建攜帶人miR-200c基因慢病毒載體質粒，實現重組體在人結腸癌HCT-116/L-OHP多藥耐藥細胞中的穩定整合，并建立了帶有熒光素酶miR-200c過表達的人結腸癌多藥耐藥動物模型。

關鍵詞:結腸癌;多藥耐藥;微小核糖核酸;慢病毒載體;動物模型;活體成像

大腸癌多藥耐藥耐藥的發生和發展是一個涉及多基因、多階段、多因素異常積累且相互作用的復雜過程［1，2］。近年來研究發現，miRNA在細胞增殖、分化、腫瘤的血管形成和轉移等方面起著重要的作用［3～5］。有研究表明，miR-200c的下調參與腫瘤多藥耐藥的發生、發展［6］，但是具體的調控機制尚不明確。2013年10月～2014年10月進行本研究，在構建攜帶miR-200c基因慢病毒載體質粒的基礎上，將其轉染人結腸癌耐奧沙利鉑(L-OHP)多藥耐藥細胞株HCT-116/L-OHP，篩選穩定表達miR-200c的HCT-116/L-OHP，并建立人結腸癌多藥耐藥的動物模型，為臨床多藥耐藥研究奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料擴增miR-200c材料為上海吉凱基因化學技術有限公司提供克隆模板; GV209靶點篩選系統慢病毒表達載體及包裝質粒(上海吉凱基因化學技術有限公司) ; Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Takara公司) ; DNA連接酶、限制性內切酶Age I和EcoR I(NEB公司) ; RNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒(QIAGEN公司) ; Lipofecter2000脂質體轉染試劑(碧云天公司) ; Marker、低熔點瓊脂糖(上海生物工程公司)。Babl/c/nu裸鼠，雄性，體質量(18±2) g，SPF級，購自中科院上海實驗動物中心，合格證編號: SCHK(新) 2008-0016。實驗前在實驗室常規飼養1周。293T細胞株、HCT-116/LOHP及其親本株HCT-116，由上海中醫藥大學中西醫結合腫瘤介入研究所保存。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體的構建及鑒定將慢病毒pHelper-GV209進行Age I酶切，線性化處理; 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段，并回收條帶。將miR-200c基因PCR產物交換進入線性化慢病毒載體，加入的線性化載體DNA和純化的PCR產物的摩爾數比例為1∶3～1∶9，設置陽性對照和自連對照。將構建好的載體質粒轉染大腸桿菌DH5α，長出克隆后進行PCR鑒定，鑒定陽性結果進行測序。

1.2.2重組慢病毒包裝取對數生長期的293T細胞，按照每孔1.2×106個細胞接種。轉染前2 h將細胞培養基更換為無血清培養基，待細胞70%融合時分別將慢病毒表達載體質粒與pGC-GFP/Lentivirus質粒混勻，加入250 μL opti-MEM去血清培養液中，并用Lipofectamine2000共轉染于相應的293T細胞組中。轉染后48 h后可置于熒光顯微鏡下觀察兩組細GFP的表達情況，確定包裝成功。72 h收集上清，3 000 r/min離心20 min，并經0.45 μm濾膜過濾后，將病毒上清于－80℃保存備用。

1.2.3病毒滴度測定孔稀釋法測定病毒滴度。將病毒儲存液按梯度稀釋至10－4，依次取10 μL加到細胞中，放入37℃、5% CO2培養箱中培養。48 h后更換培養液，3～4 d后觀察熒光表達。正常情況下，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而相應減少，計數最大稀釋倍數孔中的帶有熒光的細胞個數。病毒滴度(TU/mL)=(熒光細胞個數×轉染時細胞數/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋濃度。

1.2.4重組慢病毒載體質粒轉染人結腸癌細胞將人結腸癌多藥耐藥細胞分為2組:陰性重組慢病毒組對HCT-116/L-OHP進行陰性慢病毒Vector-Lentivirus轉染; miR-200c重組慢病毒組對HCT-116/L-OHP結腸癌細胞轉染miR-200c過表達重組慢病毒miR-200c-Lentivirus。轉染前2 d以胰酶消化HCT-116/LOHP細胞，接種于24孔板，每孔計數(1～3)×105個細胞，當細胞長至50%的培養基面積時用于轉染。將病毒原液稀釋1×106溶于5 mL培養基，100 μL Lipofeetamine2000溶于5 mL培養基。混合后20 min，緩慢加入HCT-116/L-OHP細胞中。24 h后將培養液換為含血清的RPMI 1640培養基培養。感染48 h后，將培養板中的細胞按梯度稀釋法比例接種，挑取克隆及擴增培養，并加入2 μg/mL的嘌呤霉素篩選，每隔3～5 d換液1次。當非熒光細胞幾乎被完全殺死時，降低嘌呤霉素濃度，采用維持濃度(2 μg/mL)維持細胞的篩選。10 d后可見培養板底有細胞克隆形成，并作好標記。將標記好的陽性克隆用100 μL槍頭進行挑取，移至仍為維持濃度的嘌呤霉素的完全培養液的24孔板中，繼續擴增，消化、傳代培養，凍存。建立HCT-116/L-OHP-luc細胞和HCT-116/LOHP-miR-200c-luc細胞兩個穩定轉染的細胞系。

1.2.5miR-200c mRNA檢測方法采用實時熒光定量PCR法檢測目的基因miR-200c mRNA表達。設計內參基因U6和目的基因miR-200c的引物和探針。miR-200c:上游引物為5'- ACACTCCAGCT-GGGTAATACTGCCGGGTAAT-3'，下游引物為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATCAT-3'; U6:上游引物為5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3'，下游引物為5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3'。用RNAiso試劑分別提取細胞總RNA，并逆轉成cDNA，按實時熒光定量PCR試劑盒說明進行熒光定量PCR反應。PCR反應體系(20 μL) : Premix EX TaqTM 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，熒光探針0.8 μL，dH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應條件: 94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸30 s，72℃退火10 min，共30個循環。數據采用ABI 7300 SDS Software分析。相對mRNA表達=2－ΔCt，ΔCt值=靶基因Ct值－GAPDH Ct值。

1.2.6裸鼠皮下移植瘤模型的建立方法取對數生長期的HCT-116/L-OHP、HCT-116/L-OHP-luc以及HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc細胞，以5×106/只數量接種于裸鼠腋下，每組接種6只。藥物采用臨床一線化療常用藥L-OHP，根據前期實驗用藥劑量經驗。本實驗采用5 mg/kg，0.2 mL/只，隔日1次。模型評價實驗分為3組: HCT-116/L-OHP組、HCT-116/L-OHP-luc組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc組。耐藥實驗分為4組: HCT-116/L-OHP-luc+生理鹽水(NS)組、HCT-116/L-OHP-luc+ LOHP(5 mg/kg)組、HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP(5 mg/kg)組，連續給藥35 d。以頸椎脫臼法處死，剝離腫瘤組織，稱重;并用游標卡尺測量腫瘤長、寬度，計算瘤體體積。

1.2.7實驗動物活體成像的檢測采用美國精諾真活體成像系統(IVIS 200)觀測皮下腫瘤細胞的生長情況。觀測前記錄每只裸鼠體質量，根據熒光素底物注射濃度(150 mg/kg裸鼠體質量)，腹腔注射150 μL(30 mg/mL)熒光素底物，注射后10～25 min進行活體成像，IVIS 200曝光時間為5～10 s。每周1次，持續60 d。

1.2.8統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量數據以珋x±s表示，獨立樣本采用t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1重組慢病毒載體質粒滴度測定在本次滴度檢測中，10－4μL樣品中Ct值最高(ΔCt=18.695)，認為在10－4μL樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少有1個病毒顆粒，根據病毒滴度計算公式，則病毒的滴度為2×108TU/mL。

2.2miR-200c mRNA相對表達經轉染miR-200c-Lentivirus后，HCT-116/L-OHP細胞miR-200c mRNA相對表達量為13.12±1.41，空白對照組和轉染空載體組分別為0.99±0.11和1.02±0.13; HCT-116/L-OHP細胞高于空白對照組和轉染空載體組，P均＜0.01。

2.3裸鼠皮下移植瘤模型的建立及活體成像結果HCT-116/L-OHP細胞株接種后腫瘤體積隨時間增加而增大，在觀察期內無熒光素酶活性;而構建的穩定表達細胞株HCT-116/L-OHP-luc和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc在接種10 d后均有熒光素酶表達，隨著接種天數的增加，熒光值逐漸增加，在第60天就已達到飽和。之后，腫瘤中心已出現壞死，中心熒光值降低，且HCT-116/L-OHP-luc組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc組熒光值基本維持一致。見圖1。

2.4各組瘤體大小比較給藥35 d后，HCT-116/L-OHP-luc+ NS組、HCT-116/L-OHP-luc+ L-OHP組、HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP組腫瘤體積分別為(998±90)、(500±80)、(980±80)、(300±30) mm3，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ L-OHP組小于HCT-116/L-OHP-luc+ L-OHP組，且均小于HCT-116/L-OHP-luc+ NS組和HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc+ NS組，P均＜0.05。

3　討論

腫瘤多藥耐藥是一種獨特的廣譜耐藥現象，即一旦腫瘤細胞對一種化療藥產生耐藥后，同時也對結構不同、作用機制不同的其他藥物產生交叉耐藥現象［7～9］。miRNA是近年來新發現的一類非編碼小分子RNA，長度為22～28個核苷酸，廣泛存在于真核生物細胞內，是最大的基因家族之一，占整個基因組的1%～4%［10］。其主要作用機制是與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(3'UTR)特異性的堿基互補配對，結合到靶基因mRNA上，抑制靶基因mRNA翻譯或直接使其降解，從而在轉錄后調控基因表達［11］。最新研究發現，耐藥細胞中miR-200c參與了腫瘤耐藥的發生［6，12］，但是具體機制尚不明確。

與傳統的腫瘤動物模型相比，攜帶生物發光標記的基因動物模型，可以在活體內監測腫瘤的生長和轉移、基因的表達、機體的生理病理改變過程以及進行藥物的篩選。這種可視化模型堪稱是動物模型檢測監控領域的革命性進步。因此，國內外不少研究［13，14］已經采用GFP或者紅色熒光蛋白這種特異性標記物來標記某種基因，再將該基因植入腫瘤細胞內，使腫瘤細胞成為發光源;然后接種動物體內，通過活體成像的方式及時監測活體生物體內的細胞活動和基因行為。但是，對于攜帶miRNA基因特異性標記物這方面的動物模型目前還未見文獻報道。本研究通過構建miR-200c-GFP-Lentivirus以及對照慢病毒載體質粒，將其轉染到人結腸癌HCT-116/LOHP細胞，篩選獲得穩定表達miR-200c的HCT-116/L-OHP-GFP-Lentiviru細胞株。將攜帶miR-200c的HCT-116/L-OHP細胞接種于裸鼠皮下，成功建立了miR-200c過表達結腸癌耐藥腫瘤模型，通過活體成像觀察腫瘤的生長情況，達到更直觀地評價藥物對腫瘤的治療作用。

我們的研究顯示，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc穩轉細胞株表現出和野生型HCT-116/L-OHP細胞以及HCT-116/L-OHP-luc穩轉細胞株相似的體外生長和體內轉移特性，提示它們的結腸癌耐藥的生物學特性未受影響。通過活體成像熒光表達情況，發現在瘤體增殖的同時，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc與HCT-116/L-OHP-luc的熒光值基本保持一致，說明熒光值與瘤體的大小是呈正相關［8］。該發現與大部分采用熒光載體觀測腫瘤的體內模型的研究結果一致［15，16］。體內研究發現，在裸鼠皮下移植瘤HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc模型中，miR-200c具有較強的抗化療藥物作用，與L-OHP聯合使用，可有效抑制HCT-116/L-OHP結腸癌耐藥細胞的增殖。

綜上所述，本研究成功構建了穩定過表達miR-200c的人結腸癌多藥耐藥細胞系，利用該細胞株建立了裸鼠結腸癌移植瘤模型，證明miR-200c可有效地抑制腫瘤多藥耐藥的發生。通過分子和細胞水平進行成像，直觀、活體、動態地連續觀察腫瘤的生長轉移情況，為腫瘤多藥耐藥的治療和藥物的篩選評價提供良好的技術平臺。

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Construction of miR-200c gene recombinant lentiviral vector and establishment of multi-drug resistance animal models in human colon cancer

LIU Chong1，SUI Hua，ZHU Hui-rong，LI Dong，LI Qi
(1 Tongji Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200065，China)

Abstract:Objective To construct the lentiviral vector co-expressing human miR-200c gene and luciferase，and establish a stable colorectal cancer multidrug resistance(MDR) cell model，in order to lay an experiment foundation for exploring the function of miR-200c in MDR.Methods miR-200c gene was cloned into the lentiviral vector(pGC-Lentivirus)，which was verified by PCR and sequencing analysis.After sequencing，we made lentiviral vector and titer test.Using cell transfection technique，miR-200c lentiviral vector was infected into MDR cell line HCT-116/L-OHP.A nude mouse model of colorectal MDR cancer was established by subcutaneous inoculation of this kind of cell; meanwhile，the empty vector was taken as the control group.Experimental nude mice were randomly divided into 4 groups after 2-week tumorgrowth.Mice in the control group were administered with normal saline daily.Mice in the experiment group were administered with oxaliplatin(L-OHP).After treatment for 4 weeks，mice in each group were sacrificed to measure tumor volume.Results The best titer was 2×108TU/mL.The qPCR showed that the levels of miR-200c mRNA expression in the resistant cells of human colon cancer which were transfected by miR-200c-Lentivirus were significantly higher than those in the empty vector group and the blank control group(all P＜0.01).In vivo imaging confirmed that HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc cells with luciferase could be tested quickly and sensitively，and could be used to watch the tumor growth.Compared with HCT-116/L-OHP-luc group，HCT-116/L-OHP-miR-200c-luc group showed more sensitive to L-OHP(P＜book=11,ebook=2450.05).Conclusion The lentiviral screening vector with human miR-200c gene is successfully constructed，which realizes the stable integration of the recombinant in the human colon cancer HCT-116/L-OHP MDR cells; meanwhile，its MDR colon cancer animal models which have miR-200c overexpression with luciferase are successfully constructed.

Key words:colonic carcinoma; multidrug resistance; miRNA; lentiviral vector; animal model; in vivo imaging

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者簡介:李琦(1971-)，男，教授，曙光醫院腫瘤科主任，主要研究方向為中西醫結合腫瘤防治。E-mail: Lzwf@ hotmail.com

作者簡介:第一劉沖(1985-)，男，主管技師，主要研究方向為臨床檢驗診斷學。E-mail: lc2003lc2008@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81202812，81373862，81403360) ;上海市科技委員會資助項目(13140902500) ;上海市衛生局資助項目(2011ZJ030)。

文章編號:1002-266X(2015) 20-0010-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.004