神經肽Y對原代大腦皮質神經元NMDA受體電流的影響及其機制探討

李琦軍，張淑麗，常軍英，白玉娟，穆衛盧，賈東昭，王彥志，李炎

(1石家莊市第三醫院，石家莊050011;2秦皇島市骨科醫院)

生理狀態下，小膠質細胞在中樞神經系統發揮免疫監視功能，當其受到刺激后，IL-1β、TNF-α等細胞因子大量釋放，導致神經元損傷［1，2］，其作用機理可能與激活 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體有關［3，4］。NMDA 受體本身是一種離子通道蛋白，其被激活后，離子通道開放，Ca2+、Na+、K+等陽離子進入細胞，尤其是Ca2+大量內流。離子的跨膜流動形成 NMDA受體電流(INMDA)，導致神經元損傷［5～7］。神經肽 Y(NPY)通過作用于其 Y1受體，抑制小膠質細胞過度激活和IL-1β、TNF-α表達，減輕神經元損傷。2012年6月～2014年3月，本研究觀察了NPY對原代大腦皮質神經元INMDA的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h內SD大鼠60只，雌雄不限，清潔級;河北醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(冀)2013-1-03。脂多糖(LPS，美國Sigma公司)，NPY Y1受體阻斷劑 BIBP3226(美國Tocris Bioscience公司)，NPY(美國 ENZO公司)。三維操縱器、電極拉制器(美國 Sutter instruments company公司)，700B型膜片鉗放大器(美國Axon公司)。

1.2 原代大腦皮質小膠質細胞培養及處理 取新生24 h內SD大鼠30只，無菌環境下開顱取大腦皮質，參照Nakajima等［8］方法進行原代小膠質細胞培養。對培養細胞進行免疫細胞化學熒光染色，證實小膠質細胞純度＞95%，滿足實驗需要。將純化好的小膠質細胞以1×105/mL接種于預鋪多聚賴氨酸的6孔板內，3 mL/孔。培養3 d后換新鮮無血清膠質細胞培養液，培養12 h使細胞同步化。將細胞分為1、2、3、4組，每組5孔。1組以無血清膠質細胞培養液孵育6 h;2組以含終濃度為100 ng/mL LPS的無血清膠質細胞培養液孵育6 h;3組先以含NPY(1 μmol/L)的無血清膠質細胞培養液孵育0.5 h，然后加入LPS(100 ng/mL)繼續孵育6 h;4組先用含BIBP3226(1 μmol/L)的無血清膠質細胞培養液孵育0.5 h，再加入 NPY(1 μmol/L)孵育 0.5 h，最后加入LPS(100 ng/mL)繼續孵育6 h。

1.3 原代大腦皮質神經元培養及處理 取新生24 h內SD大鼠30只，無菌環境下開顱取大腦皮質，參照Yang等［9］方法進行原代神經元培養。對培養細胞進行免疫細胞化學熒光染色，證實神經元純度＞95%，滿足實驗需要。將純化好的神經元分為1、2、3、4組，每組5孔，分別加入相對應的小膠質細胞條件培養液，繼續孵育神經元6 h。小膠質細胞培養液、神經元培養液體積比為1∶1。

1.4 神經元INMDA檢測 混合培養液孵育神經元6 h后，采用標準全膜片鉗技術記錄神經元將各組神經元爬片取出，置于0.3 mL浴槽，采用細胞外液(2 mL/min)持續灌流細胞，保證液體交換在2 min內完成。倒置顯微鏡下觀察細胞，選擇輪廓清晰、立體感強、表面光滑的5個神經元進行封接實驗。三維操縱器阻抗為1～3 MΩ。將灌充電極內液的玻璃微電極與細胞表面形成封接，加大負壓至吸破細胞，補償電容電流和電極串聯電阻，形成全細胞記錄。設置鉗制電壓為-60 mV。形成全細胞模式后穩定5 min，至細胞內液和電極內液完全置換。細胞外給予100 μmol/L NMDA 和10 μmol/L甘氨酸誘發電流發生內向型變化，此電流即INMDA。計算INMDA峰值電流的電流密度。

1.5 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。符合正態性和方差齊性要求的數據，采用完全隨機設計的方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

1、2 、3、4 組INMDA峰值電流密度分別為(23.19 ±1.29)、(38.91 ±3.29)、(27.09 ±2.58)、(35.56 ±3.92)Pa/Pf;與1組相比，2組電流密度增強(P＜0.05);與2組相比，3組電流密度降低(P＜0.05);與3組比較，4組電流密度上升(P＜0.05)。

3 討論

小膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統，在中樞神經系統內行使免疫監視和防御功能，是腦內重要的免疫細胞。激活的小膠質細胞形態可從分支狀變成圓形或阿米巴狀，細胞內多種細胞因子的轉錄和表達也隨之增高，釋放各種生物活性物質。這些生物活性物質大量產生并積聚于中樞神經系統，對神經元產生毒性作用。LPS是由氨基甙組成的磷脂，是革蘭陰性桿菌細胞壁的組成成分之一。LPS對神經元無明顯影響，但對小膠質細胞有很強的激活作用。LPS激活后的小膠質細胞會生成多種生物活性物質，導致神經元損傷和凋亡。

NMDA是外源性NMDA受體選擇性激動劑，與NMDA受體結合后，使細胞膜去極化，開放相應離子通道。甘氨酸是NMDA受體復合體的正性變構調制物。在甘氨酸存在的情況下，NMDA對NMDA受體的激活效應大大增加。因此，本研究中采用NMDA和甘氨酸共同作用，以激活NMDA受體。將各組小膠質細胞培養液和神經元培養液1∶1混合后孵育神經元，既保證了神經元細胞成活需要的各種營養成分，又能保持膠質細胞培養液中物質與神經元的有效接觸。膜片鉗技術檢測結果顯示，含LPS的培養液孵育小膠質細胞后，再用此培養液孵育神經元，神經元INMDA較1組增強;提示小膠質細胞激活引起神經元INMDA增強，被LPS活化后的小膠質細胞可以通過非直接接觸途徑增加神經元INMDA。提前在膠質細胞培養液中加入NPY，能夠明顯抑制LPS對小膠質細胞的激活作用，其培養液孵育的神經元INMDA增強幅度明顯下降;說明NPY能夠通過作用于小膠質細胞，抑制神經元INMDA過度增強。再加入NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226，NPY的上述作用消失;說明NPY通過激活其Y1受體來抑制神經元INMDA過度增高。但上述結果還需進一步研究以證實。

［1］Fukuda M，Suzuki Y，Ishizaki Y，et al.Interleukin-1β enhances susceptibility to hyperthermia-induced seizures in developing rats［J］.Seizure，2009，18(3):211-214.

［2］Shandra AA，Godlevsky LS，Vastyanov RS，et al.The role of TNF-α in amygdala kindled rats［J］.J Neurosci Res，2002，42(2):147-153.

［3］Zhu W，Zheng H，Shao X，et al.Excitotoxicity of TNFα derived from KA activated microglia on hippocampal neurons in vitro and in vivo［J］.J Neurochem，2010，114(2):386-396.

［4］Viviani B，Bartesaghi S，Gardoni F，et al.Interleukin-1β enhances NMDA receptor-mediated intracellular calcium increase through activation of the Src family of kinases［J］.J Neurosci，2003，23(25):8692-8700.

［5］Norris CM，Blalock EM，Thibault O，et al.Electrophysiological mechanisms of delayed excitotoxicity:positive feedback loop between NMDA receptor current and depolarization-mediated glutamate release［J］.J Neurophysiol，2006，96(5):2488.

［6］Deshpande LS，Lou JK，Mian A，et al.Time course and mechanism of hippocampal neuronal death in an in vitro model of status epilepticus:role of NMDA receptor activation and NMDA dependent calcium entry［J］.Eur J Pharmacol，2008，583(1):73-83.

［7］Metzler M.Mutations in NMDA receptors influence neurodevelopmental disorders causing epilepsy and intellectual disability［J］.Clin Genet，2011，79(3):219-220.

［8］Nakajima K，Tsuzaki N，Shimojo M，et al.Microglia isolated from rat brain secrete a urokinase-type plasminogen activator［J］.Brain Res，1992，577(2):285-292.

［9］Yang S，Zhou W，Zhang Y，et al.Effects of Liuwei Dihuang decoction onion channels and synaptic transmission in cultured hippocampal neuron of rat［J］.J Ethnopharmacol，2006，106(2):166-172.

［10］Yang S，Liu ZW，Wen L，et al.Interleukin-1β enhances NMDA receptor-mediated current but inhibits excitatory synaptic transmission［J］.Brain Res，2005，1034(1):172-179.

［11］Zhang XJ，Liu LL，Wu Y，et al.Sigma receptor 1 is preferentially involved in modulation of N-Methyl-D-Aspartate receptor-mediated light-evoked excitatory postsynaptic currents in rat retinal ganglion cells［J］.Neurosignals，2011，19(2):110-116.