三向連接構(gòu)造組合引物介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸道病毒71型方法的建立

周敏，張宏萍，陸仁飛，李雪梅( 南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通600;南通市第三人民醫(yī)院)

三向連接構(gòu)造組合引物介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)腸道病毒71型方法的建立

周敏1，張宏萍1，陸仁飛2，李雪梅2
( 1南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通226001;2南通市第三人民醫(yī)院)

摘要:目的建立三向連接構(gòu)造( 3WJ)組合引物介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增( PG-RCA)技術(shù)檢測(cè)腸道病毒71型( EV71)的方法，并驗(yàn)證其檢測(cè)效果。方法根據(jù)EV71的VP1基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物模板、引物以及環(huán)狀探針前體，確立反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，實(shí)時(shí)熒光PCR儀監(jiān)測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。采用已建立的3WJ組合PG-RCA技術(shù)檢測(cè)16例手足口病患兒咽拭子標(biāo)本( EV71陽(yáng)性12例、柯薩奇病毒A陽(yáng)性2例、柯薩奇病毒B陽(yáng)性2例)。結(jié)果已建立的3WJ組合PG-RCA技術(shù)能檢測(cè)到amol級(jí)的EV71 RNA，說(shuō)明方法建立成功。EV71陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度均超過(guò)閾值;柯薩奇病毒A、B陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度均低于閾值。結(jié)論成功建立3WJ組合PG-RCA技術(shù)檢測(cè)EV71的方法，檢測(cè)效果好。

關(guān)鍵詞:腸道病毒71型;恒溫?cái)U(kuò)增;滾環(huán)擴(kuò)增;三向連接

Establishment of three-way junction formation and primer generation-rolling circle amplification for detection of EV71

ZHOU Min1，ZHANG Hong-ping，LU Ren-fei，LI Xue-mei
( 1 Nantong Center for Diseases Control and Prevention，Nantong 226001，China)

Abstract:Objective To establish a method of combining three-way junction ( 3WJ) formation and primer generation-rolling circle amplification ( PG-RCA) for the detection of enterovirus 71 ( EV71) and to verify its detection effect.Methods According to conservative EV71 VP1 gene，we designed template of primer，primer and circular probe precursor to detect EV71 with an isothermal reaction format.Real-time fluorescence PCR was used to detect the amplification.Using the established 3WJ combined with PG-RCA technology to detect the pharyngeal swab specimens in 16 cases of children with hand，foot and mouth disease ( 12 cases of positive EV71，2 cases of positive coxsackie virus A and 2 cases of positive coxsackie virus B).Results The 3WJ combined PG-RCA technology could detect the amol level of synthetic EV71 RNA.The detection method had good specificity and sensitivity.The amplification curve fluorescence intensity of EV71 positive specimens was stronger than the threshold，and the amplification curve fluorescence intensity of Coxsackie virus A and B positive specimen was lower than the threshold.Conclusion The 3WJ combined PG-RCA technology is established successfully with good detection effect.

Key words:enterovirus 71; isothermal amplification; rolling circle amplification; three-way junction

腸道病毒71型( EV71)屬小RNA病毒科、腸道病毒屬成員，是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性，重癥患者比例明顯高于其他腸道病毒，在世界范圍內(nèi)已引起10余次的暴發(fā)和流行［1，2］。常規(guī)的EV71診斷技術(shù)包括免疫學(xué)方法、病毒分離培養(yǎng)、PCR方法等，但大多存在難以早期診斷或敏感性、特異性低等缺陷。2011年日本學(xué)者M(jìn)urakmi等發(fā)明了一種新的RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即三向連接構(gòu)造( 3WJ)組合引物介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增( PG-RCA)技術(shù)，該技術(shù)是一種信號(hào)放大技術(shù)，可以檢測(cè)到amol( 10-18mol)級(jí)的RNA［3～7］。本研究根據(jù)EV71 VP1基因區(qū)保守序列設(shè)計(jì)了一套引

物模板、引物以及環(huán)狀探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立3WJ組合PG-RCA技術(shù)檢測(cè)EV71的方法，并驗(yàn)證其檢測(cè)效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料及試劑收集2003年8月～2004年9月手足口病患兒咽拭子標(biāo)本16例，其中EV71陽(yáng)性樣本12例、柯薩奇病毒A( CoxA)陽(yáng)性標(biāo)本2例、柯薩奇病毒B ( CoxB)陽(yáng)性標(biāo)本2例，均經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)陽(yáng)性以及測(cè)序驗(yàn)證。以上標(biāo)本均由南通市疾病預(yù)防控制中心微生物科提供。Vent( exo-) DNA聚合酶、Nb.BsmIQ、外切酶Ⅲ、ssRNA Ladder Mark ( NEB)、Circligase ssDNA ligase，購(gòu)自外切酶ⅠEpicentre Biotechnologies，引物及探針由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 3WJ組合PG-RCA檢測(cè)EV71技術(shù)的建立

1.2.1靶序列、引物模板、引物及探針的設(shè)計(jì)NCBI搜索20個(gè)EV71 VP1基因序列，對(duì)20條序列進(jìn)行比對(duì)，在其保守區(qū)選取66個(gè)堿基的保守序列作為靶序列，命名為RNA71，同時(shí)根據(jù)RNA71序列設(shè)計(jì)引物模板、引物、環(huán)狀探針前體;見(jiàn)表1。

表1　 EV71的靶序列、模板、引物及環(huán)狀探針

1.2.2環(huán)狀探針的建立20 mmol/L環(huán)狀探針前體、200 U Circligase ssDNA、10×連接酶緩沖液，ddH2O補(bǔ)充體積至20 μL，60℃恒溫3 h;在反應(yīng)體系內(nèi)加入10 U外切酶Ⅰ和100 U外切酶Ⅲ，37℃消化過(guò)夜。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳純化2次，回收環(huán)狀探針，并經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.3 RNA71擴(kuò)增條件的確立將RNA71配比成5個(gè)10倍梯度稀釋，即2.5×10-14、2.5×10-13、2.5×10-12、2.5×10-11、2.5×10-10mol/L。3WJ反應(yīng)體系5 μL，即RNA71( 5個(gè)濃度分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn))、1 nmol/L引物模板、1 nmol/L引物，1×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補(bǔ)足5 μL; 80℃變性3 min， 37℃退火30 min。再加入0.8 μmol/L dNTP、15 nmol/L環(huán)狀探針、0.05 U Vent( exo-) DNA聚合酶、1 U Nb.BsmI，1×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補(bǔ)足5 μL; 60℃恒溫?cái)U(kuò)增。ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀監(jiān)測(cè)3 h。

1.3臨床標(biāo)本檢測(cè)12例EV71、2例CoxA、2例CoxB標(biāo)本均采用磁珠法提取病毒RNA，－80℃凍存?zhèn)溆谩２捎?WJ組合PG-RCA技術(shù)檢測(cè)EV71。反應(yīng)體系: 0.5 μL標(biāo)本RNA、1 nmol/L引物模板、1 nmol/L引物、1×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補(bǔ)足5 μL。反應(yīng)條件: 80℃變性3 min，37℃退火90 min。再加入0.8 μmol/L dNTP、15 nmol/L環(huán)狀探針、0.05 U Vent( exo-) DNA聚合酶、1 U Nb.BsmI，1 ×Vent( exo-) DNA聚合酶緩沖液補(bǔ)足5 μL; 60℃恒溫?cái)U(kuò)增。ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀監(jiān)測(cè)3 h，觀察反應(yīng)熒光強(qiáng)度。

2　結(jié)果

2.1 3WJ組合PG-RCA檢測(cè)EV71技術(shù)的建立在100 bp左右獲得1個(gè)清晰的條帶，即環(huán)狀探針，見(jiàn)圖1。5個(gè)10倍梯度稀釋的RNA71經(jīng)3WJ組合PG-RCA技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增后，ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線按濃度高低依次超過(guò)閾值，見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1。

圖1　15%聚丙烯酰胺凝膠電泳回收的環(huán)狀探針

2.2臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果12例EV71陽(yáng)性臨床標(biāo)本擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度超過(guò)閾值; 2例CoxA、2例CoxB陽(yáng)性臨床標(biāo)本擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度低于閾值; 2份陰性對(duì)照臨床標(biāo)本擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度低于閾值。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖2。

3　討論

手足口病是指手、足、口腔等部位出現(xiàn)紅色斑丘疹，伴有或不伴有發(fā)熱的一種急性傳染病，可由多種腸道病毒感染引起，如EV71、CoxA、CoxB、埃可病毒

等。EV71感染可出現(xiàn)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，CoxA16感染一般不合并嚴(yán)重并發(fā)癥［8～12］。臨床上對(duì)手足口病患兒感染的病原體進(jìn)行早期診斷，尤其是EV71的鑒別診斷對(duì)其預(yù)后尤為關(guān)鍵。但是，對(duì)于條件相對(duì)落后的基層衛(wèi)生中心來(lái)說(shuō)，由于設(shè)備和技術(shù)人員的限制，很難及時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)EV71; 且EV71是RNA病毒，運(yùn)送標(biāo)本過(guò)程中極易降解或污染。因此，尋找簡(jiǎn)便易行的EV71檢測(cè)方法尤為重要［13～16］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，新的核酸擴(kuò)增技術(shù)不斷出現(xiàn)。3WJ組合PG-RCA技術(shù)是一種改良的PG-RCA方法，其特點(diǎn)是根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)引物模板、引物、環(huán)狀探針，三者兩兩雜交形成一個(gè)三向立體結(jié)構(gòu)3WJ，產(chǎn)生信號(hào)引物;產(chǎn)生的信號(hào)引物通過(guò)引物介導(dǎo)的PG-RCA進(jìn)一步放大信號(hào)引物;利用SYBR GreenⅠ染料作為顯示系統(tǒng)，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。本研究首先建立3WJ組合PG-RCA技術(shù)檢測(cè)EV71的方法，然后證明了該方法可以對(duì)手足口病患兒咽拭子標(biāo)本中的EV71進(jìn)行鑒別診斷。本研究合成了1個(gè)50個(gè)堿基長(zhǎng)的EV71基因片段RNA71，利用3WJ組合PG-RCA技術(shù)對(duì)RNA71不同稀釋度的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)能檢測(cè)到低至amol級(jí)的EV71 RNA，說(shuō)明該方法的擴(kuò)增效率更高。與常規(guī)檢測(cè)EV71的RT-PCR方法相比，3WJ組合PGRCA技術(shù)具備以下優(yōu)點(diǎn):①操作簡(jiǎn)單、步驟少，實(shí)驗(yàn)前一次性加完所有試劑; RT-PCR方法需逆轉(zhuǎn)錄及PCR兩個(gè)實(shí)驗(yàn)才能完成檢測(cè)。②不需要昂貴溫控PCR設(shè)備，只需1個(gè)恒溫設(shè)備和1個(gè)信號(hào)收集設(shè)備(雖然本實(shí)驗(yàn)利用了實(shí)時(shí)熒光PCR儀，但我們僅利用了儀器的恒溫及收集熒光的功能) ; RT-PCR方法需要精密的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，對(duì)操作分析人員技術(shù)要求較高。③本檢測(cè)方法不開(kāi)蓋，擴(kuò)增的單鏈引物片段易降解，大大降低了普通PCR過(guò)程中的污染概率。

總之，本研究成功建立了3WJ組合PG-RCA技術(shù)檢測(cè)EV71的方法，檢測(cè)效果好。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-01-04)

通信作者簡(jiǎn)介:張宏萍( 1968-)，主管技師，主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)微生物。E-mail: rainman78@163.com

作者簡(jiǎn)介:第一周敏( 1978-)，主管技師，主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)微生物。E-mail: teddy76@ sina.com

基金項(xiàng)目:江蘇省南通市科技項(xiàng)目( HS2013028) ;江蘇省南通市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目( W201224)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 28-0021-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R446.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.007