N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理對(duì)心臟移植大鼠供心缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制探討

韓燕，李占清，王帥，鄔鵬宇，崔翔宇，楊學(xué)慧，王耕銀，楊方，鄭素琴，伊雪( 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000;華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院)

N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理對(duì)心臟移植大鼠供心缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制探討

韓燕1，李占清2，王帥2，鄔鵬宇2，崔翔宇2，楊學(xué)慧2，王耕銀2，楊方1，鄭素琴1，伊雪1
( 1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000;2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院)

摘要:目的觀察N-乙酰半胱氨酸( NAC)預(yù)處理對(duì)心臟移植大鼠供心缺血再灌注損傷( IRI)的影響，并探討其機(jī)制。方法60只健康雄性Lewis大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、NAC供體預(yù)處理組、NAC受體預(yù)處理組各20只，每組10只分別作為心臟移植供體和受體。對(duì)照組、供體預(yù)處理組于摘取供體心臟前30 min經(jīng)供體大鼠下腔靜脈分別注射生理鹽水0.5 mL、NAC 300 mg/kg，受體大鼠不處理;受體預(yù)處理組移植前30 min經(jīng)受體大鼠下腔靜脈注射NAC 300 mg/kg，供體大鼠不處理。三組均行同種異體異位心臟移植，移植后24 h摘取移植心臟。光鏡、電鏡下觀察心肌組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化，用免疫組化SABC法檢測(cè)心肌組織中的Caspase-3蛋白。結(jié)果光鏡、電鏡下，NAC預(yù)處理組心肌損傷較對(duì)照組減輕; NAC受體預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達(dá)量高于NAC供體預(yù)處理組和對(duì)照組( P均＜0.05)，NAC供體預(yù)處理組和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論NAC預(yù)處理可減輕心臟移植大鼠供心IRI程度，該作用與其抑制心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞:N-乙酰半胱氨酸;心臟移植;缺血再灌注損傷;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

心肌細(xì)胞凋亡、壞死是心肌缺血再灌注損傷( IRI)的重要機(jī)制［1］。N-乙酰半胱氨酸( NAC)是細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的前體，可通過提高氧化酶活性減少心肌細(xì)胞損傷［2～5］，增加移植成功率。但是，NAC是否通過抗凋亡途徑保護(hù)移植心臟，尚未見報(bào)道。2012年9月～2014年12月，我們觀察了N-乙酰半胱氨酸( NAC)預(yù)處理對(duì)心臟移植大鼠供心凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)水平的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組及干預(yù)60只Lewis雄性大鼠(近交系，體質(zhì)量200～220 g，由德國(guó)海德堡大學(xué)動(dòng)物室提供，常規(guī)飼養(yǎng))隨機(jī)分為對(duì)照組、NAC供體預(yù)處理組、NAC受體預(yù)處理組各20只，每組10只分別作為心臟移植供體和受體。對(duì)照組、NAC供體預(yù)處理組供體大鼠摘取供心前30 min經(jīng)下腔靜脈分別注射生理鹽水0.5 mL、NAC 300 mg/kg，受體大鼠不做任何處理; NAC受體預(yù)處理組受體大鼠于移植前30 min經(jīng)下腔靜脈注射NAC 300 mg/kg，供體大鼠不予處理。三組按文獻(xiàn)［6］方法行同種異體異位心臟移植，移植后24 h摘取移植心臟。

1.2心肌組織學(xué)觀察取各組移植心上小塊左心室壁心肌組織置于4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫色、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織學(xué)變化。

1.3心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察于冰臺(tái)上取1 mm× 1 mm×1 mm小塊心肌組織，2.5%戊二醛固定，環(huán)氧樹脂浸透、包埋、超薄切片，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.4心肌組織Caspase-3表達(dá)測(cè)定采用免疫組化SABC法。取心肌組織石蠟切片，二甲苯浸泡，梯度乙醇水化，用PBS( pH 7.4)沖洗2次。放入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，煮沸熱修復(fù)抗原;經(jīng)一抗、二抗處理，滴加試劑SABC;各步間均用PBS漂洗3次，DAB顯色、自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。光鏡下觀察，Caspase-3陽性表達(dá)為心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒［7］。陽性細(xì)胞百分比:無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞百分比1%～10%為1分，10%～50%為2分，50%～80%為3分，80%～100%為4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度:無陽性反應(yīng)為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。Caspase-3蛋白表達(dá)量用上述兩項(xiàng)評(píng)分之積表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1心肌組織學(xué)變化對(duì)照組移植心心肌間質(zhì)水

腫，內(nèi)膜下有大量炎細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，間質(zhì)小血管擴(kuò)張、充血，血管壁增厚，周圍炎細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)明顯，心肌細(xì)胞萎縮、斷裂，心肌損壞嚴(yán)重。NAC供體預(yù)處理組移植心心肌間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞腫脹較明顯，心肌損傷較對(duì)照組輕。NAC受體預(yù)處理組移植心心肌組織中心肌間質(zhì)散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別心肌細(xì)胞水腫，心內(nèi)膜損傷較對(duì)照組和NAC供體預(yù)處理組輕。

2.2心肌超微結(jié)構(gòu)變化對(duì)照組移植心心肌纖維排列紊亂，部分肌絲斷裂、溶解，肌漿網(wǎng)擴(kuò)大，線粒體腫脹，線粒體膜不清晰，見空泡形成。NAC供體預(yù)處理組移植心心肌纖維排列規(guī)則，少數(shù)線粒體腫脹，線粒體膜基本完整，見少量空泡形成。NAC受體預(yù)處理組移植心心肌纖維排列整齊，肌節(jié)明暗帶清晰，線粒體排列整齊，線粒體膜完整。

2.3心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)NAC受體預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達(dá)量( 2.10±0.29)高于NAC供體預(yù)處理組( 1.25±0.05)和對(duì)照組( 1.21± 0.07)，P均＜0.05; NAC供體預(yù)處理組和對(duì)照組比較，P＞0.05。

3　討論

細(xì)胞凋亡是生理和病理情況下通過基因調(diào)控和酶促反應(yīng)進(jìn)行的細(xì)胞程序性死亡，是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境平衡的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制。細(xì)胞凋亡由許多細(xì)胞凋亡相關(guān)基因控制，凋亡誘導(dǎo)因素通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活相關(guān)基因調(diào)控凋亡。Caspase家族是一類進(jìn)化相對(duì)保守、在特異天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種細(xì)胞凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分［7～9］。活化后的Caspase-3可切斷天冬氨酸殘基后肽鍵，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、DNA斷裂，是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子［10～12］。

NAC是含有活性巰基的化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用，能干擾自由基生成、清除已生成的自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活性。近年來，NAC在減輕心、腎、肺等臟器IRI中的作用日益受到重視［13～16］。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和NAC供體預(yù)處理組大鼠心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較NAC受體預(yù)處理組重，細(xì)胞壞死和凋亡較多，線粒體損傷較重; NAC受體預(yù)處理組Caspase-3蛋白表達(dá)量高于NAC供體預(yù)處理組和對(duì)照組，而NAC供體預(yù)處理組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，NAC預(yù)處理可減輕心臟移植大鼠供心IRI，該作用可能與其抑制Caspase-3蛋白表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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收稿日期:( 2015-02-10)

通信作者:伊雪

基金項(xiàng)目:河北省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助項(xiàng)目( 20100511)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)30-0028-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R654.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.010