中藥材中黃曲霉毒素檢測方法初探

安徽省銅陵市第四人民醫院（244000）王方

1 黃曲霉毒素介紹

1960年，在英國東南部一些農場中，有大約10萬只火雞不明原由地突然死亡，一時間在人群中造成了極大的恐慌和不安，當時命名為“火雞事件”。1961年發現飼料中混有的花生粕能夠使大鼠誘發肝癌，1962年鑒定了這種致癌物質，并命名為黃曲霉毒素。從此，世界各國科學界開始對真菌毒素[1]的研究引起了廣泛的重視。黃曲霉毒素也稱作黃曲霉素[2]，是一種有強烈生物毒性的化合物，常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產生，如大米、豆類、花生等，是目前為止最強的致癌物質。加熱至280℃以上才開始分解，所以一般的加熱不易破壞其結構。黃曲毒素主要有B1、B2、G1與G2等4種，又以B1的毒性最強。食米儲存不當，極容易發霉變黃，產生黃曲毒素。黃曲毒素與肝癌有密切關系，還會引起組織失血、厭食等癥狀[3]。1960年在英國發生了因喂食黃曲毒素花生粕而導致大批火雞暴斃事件。警惕黃曲毒素的危害，要注意剔除霉變的食物顆粒，還可采用以水淘洗的辦法進一步凈化易沾染的食物中的霉菌。當然，用高溫燒、炸至280℃以上也可以達到分解毒素和去除污染的效果[6]。

黃曲霉毒素（Aflatoxins）CAS號 1402-68-2，是一組化學結構類似的化合物，目前已分離鑒定出12個黃曲霉毒素種包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，H1，GM，B2a和毒醇。黃曲霉毒素的基本結構為二呋喃環和香豆素，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物。即含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。前者為基本毒性結構而后者與致癌有關。M1是黃曲霉毒素B1在體內經過羥化而衍生成的代謝產物。黃曲霉毒素的主要分子型式含 B1，B2，G1，G2，M1，M2等。其中M1和M2 主要存在于牛奶中。B1為毒性及致癌性最強的物質。黃曲霉毒素主要由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4種產生。五種黃曲霉毒素是B1、B2、G1、G2、M1。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在體內經過羥化而衍生成的代謝產物。 黃曲霉毒素被國際腫瘤研究機構IARC分類定為1級致癌物，致癌力是奶油黃的900倍，苯并芘的4000倍。黃曲霉毒素 B1同肝細胞DNA的鳥嘌呤堿基結合，使得控制細胞生長的基因代碼發生錯誤，從而使細胞生長失控，成為癌性腫瘤。

2 黃曲霉毒素檢測方法

2.1 薄層色譜法[8]樣品中黃曲霉毒素B1經提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產生藍紫色熒光，根據其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。精密稱取1mg～1.2mg的黃曲霉毒素B1標準品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。該標準溶液約為10μg/mL。用紫外分光光度計測此標準溶液的最大吸收峰的波長及該波長的吸光度值。純度的測定：取5μL（10μg/mL）黃曲霉毒素B1標準溶液，滴加于薄層板上，用甲醇-三氯甲烷（4-96）與丙酮-三氯甲烷（8-92）展開劑展開，在紫外燈下觀察熒光的產生：只有單一的熒光點，無其他雜質熒光點，原點上沒有任何殘留的熒光物質。黃曲霉毒素B1標準使用液：用苯-乙腈混合液準確稀釋標準溶液至每毫升相當于0.2μg及0.04μg黃曲霉毒素B1。

2.2 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附試驗是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應板)表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

2.3 熒光光度法 激發波長360nm，發射波長450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調節熒光光度計的讀數值為0μg/L，以熒光光度計校準溶液調節熒光光度計的讀數值為20μg/L。

2.4 柱后碘衍生法 供試品溶液的制備：取供試品粉末5g（過二號篩），精密稱定，精密加入70%甲醇溶液25ml，超聲處理20分鐘，離心10分鐘（離心速度3500轉/分），精密量取上清液5ml，置50ml量瓶中，加70%甲醇5ml，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取25ml，通過免疫親和柱，流速每分鐘3ml，加水5ml洗滌，過空氣10秒，略放置后，分次加甲醇1.5ml洗脫，自然洗脫，過空氣10秒，氮吹至0.6～0.7ml，加水定容至1ml。使用C18柱，流動相為甲醇-乙腈-水（40∶18∶42），流速0.8ml/分鐘，柱后碘衍生，熒光檢測器。

2.5 柱后光衍生法 使用C18柱，流動相為甲醇-乙腈-水（13.5∶13.5∶73 →20∶20∶60），流速1.1ml/分鐘，柱后光衍生，熒光檢測器（其他同碘衍生法）。

3 黃曲霉毒素檢測過程質量控制

3.1 線性與校準曲線 實驗室首次進行并建立黃曲霉毒素檢測方法時，應進行回收率試驗。方法驗證回收率，三水平添加，0.5、2（5）、10ppb，每個3份，共9份。回收率要求70%～110%

3.2 隨行回收或隨行工作對照 每次檢測時進行回收率試驗隨行回收率至少做1份限度水平的隨行回收率。

3.3 空白對照 采用的試劑和水一般要經過特別凈化，分析過程中有良好的操作規范，保證不受到環境等污染。

4 黃曲霉毒素檢測安全防護

相對獨立的試驗空間，所有儀器、文具、白大褂等專用，操作過程中全程帶手套。試驗用器皿1%次氯酸鈉溶液浸泡過夜后再進行清洗。廢棄物也要用次氯酸鈉滅菌后再丟棄。流動相廢液用次氯酸鈉滅菌后歸為一般廢液處理。

5 討論

柱后光衍生法精確度高成本低，使用簡便，是最佳的黃曲霉毒素檢測方法，它的主要優點有：安裝調試簡單，開機即可用；不需要其它衍生劑（柱后碘衍生需要碘衍生液，衍生液見光易升華），保證了HPLC系統的重現性和使用壽命；通用性：除做黃曲霉毒素外，還可以對其他化學物質成分進行檢測如農藥和磺胺等；價格便宜，不到電化學衍生器價格的1半，不到化學衍生設備價格的1/4。