骨結構重建的細胞力學研究進展

霍波，白雪

北京理工大學宇航學院，北京 100081

骨結構重建的細胞力學研究進展

霍波，白雪

北京理工大學宇航學院，北京 100081

在19世紀末人們就已經認識到，骨骼所處的力學狀態改變時，骨內結構就會發生相應的變化和調整，并形成優化的承力結構。如何解釋這種力致骨重建現象的細胞-分子機制是目前骨細胞力學方向的主要研究任務。本文綜述了力學刺激作用下骨組織細胞的生物學響應，并分析了其所處的不同力學微環境，即基質變形、振動、流體剪切力、壓力和微損傷等，對骨組織結構重建的影響。

骨組織；骨質疏松；力學微環境；力學刺激；骨重建

人們在日常生活中已經注意到很多“廢用導致骨吸收”的現象，例如長期臥床的患者會發生骨質流失，從而導致骨質疏松疾病；又如航天員因為長期處于微重力環境其體內某些部位的骨質會以每月2%的速度流失［1］。反之，體育鍛煉或適當的運動則會增加骨質，例如網球運動員用于擊球的手臂的骨質密度顯著高于另一側手臂。那么，運動和廢用與骨結構的關系是什么呢？實際上，早在19世紀末，德國骨科醫生Julius Wolff（1836-1902）就已經發現骨的結構可以順應于力的傳遞方向而發生優化［2］，他的這一發現也被稱為“Wolff定律”，至今仍是骨力學生物學領域的主要研究課題。

Wolff定律的重要性在于揭示了骨結構隨力學環境發生順應性改變的過程并非自然選擇的后果，而是在生命體的發育和生長過程中發生的。成人體內的骨中既有骨形成也有骨吸收發生，這兩個過程的動態平衡維持著骨骼的結構及其功能，如果其中任一過程受到抑制或過分活躍，都會引起骨骼的疾病。因此骨組織的結構重建最終是由其中的細胞來調控的，從而深入透徹地理解力致骨重建的細胞/分子水平的響應機制對于真正闡明Wolff定律具有至關重要的作用。

由于骨的微觀結構的復雜性，因此骨內的細胞會受到非常復雜的力學作用。骨組織中的幾種主要細胞都是貼壁細胞，基質的力學性質、拓撲形貌都會影響細胞與基質間的粘附性質，進而影響細胞的生物學行為。人體的運動是周期性的，從而不可避免地在細胞周圍產生力學刺激的動態變化，進而會影響細胞的生物學響應。另外，由于骨的多孔性質，以及孔隙內液體的存在，在外力作用下不同位置處的液體壓強會出現差異，從而引起液體的流動，并會在細胞表面造成流體剪切力。應該指出的是，骨的變形和液體流動還會對細胞施加壓力作用。隨著骨骼的生長或外載荷的作用，骨內會存在大量的微損傷，從而改變了細胞周圍的基質結構，造成其力學環境的變化。下面具體介紹近年來骨細胞力學方向的相關研究進展，主要內容為分析骨組織細胞周圍力學環境的幾個主要狀態，即基質變形、振動、流體剪切力、壓力和損傷等，對骨組織結構重建的影響。

1 基質變形

骨組織中的幾種細胞，如間充質干細胞、成骨細胞、骨細胞、破骨細胞等，都粘附于胞外基質中。當骨受到力學刺激時，最直接的響應是骨內基質的變形。這種變形會通過胞外基質傳遞到細胞，進而引起細胞膜及其內部結構的變形并進而引起生物學響應。由于通常人體所受的力學載荷是周期性變化的，因而傳遞到細胞周圍的基質變形也應是動態的。

多項研究顯示，應變刺激的應變峰值是影響成骨響應的主要因素。當改變應變峰值而維持其它參數不變時，新骨形成的量與應變峰值有密切相關性［3］。人體正常運動時骨基質發生的平均應變約在500 με-2500 με（1 με=10-6） 范圍內，如果平均應變值超過0.7%（7000 με）時骨就會發生永久性的損傷［4］。生理狀態下骨應變一般不會超過1000 με，但研究發現此應變水平并不能在骨細胞和成骨細胞上引起響應［5］，實際上并不能解釋力學刺激引起細胞響應進而調控骨重建的假設。

由于上述提到的只是組織內的平均應變，人們開始懷疑在骨細胞周圍的局部應變可能超過這個范圍，例如，骨細胞突周圍、骨陷窩內、骨重建單位內等處都會發生應變集中。2001年You等人建立了一個較為簡單的模型，他們假設肌動蛋白纖維沿細胞突軸向排列，肌動蛋白纖維間由絲束蛋白連接，細胞突與骨小管壁面間通過與整合素相關的橫向纖維單元連接［6］。You等人隨后確實觀察到了骨細胞突的超微結構［7］，在此基礎上Han等人建立了一個更為精細的流體彈性動力學模型，研究了骨細胞突上流體導致應變放大的力學機制［8］。當骨所受的生理載荷為20 MPa時，按行走頻率1 Hz計算，組織水平應變約為1000 με，此種情況下按Han等人的模型，細胞水平的應變是5000 με，從而足以引起細胞內的信號傳導。

2 振動

1971年，Hert等人首次發現，骨重建由動態應變調控的，而靜態應變并不能影響骨的重建［9］。近年來更為深入的研究表明，這種調控作用依賴于振動頻率、加載間隔時間和加載率等參數。

頻率 Turner等人的工作表明載荷頻率和應變率是調控骨適應性變化的重要因素［10］。施加相同大小的應變刺激時，高應變頻率會引起更為顯著的適應性骨重建［11］。相似地，與1 Hz刺激相比，15 Hz至60 Hz的力學刺激可引進更高的骨生長［12］。每天施加10 min的力學刺激，當頻率由1 Hz至60 Hz變化時，維持骨量所需的載荷大小有不同的閾值。實驗中發現1 Hz刺激要求700 με縱向應變來維持現存骨量，而30 Hz則只要求400 με，60 Hz要求270 με。又如，對兔前肢施加10 Hz周期性載荷時，比1 Hz時的骨形成高10倍左右［13］。這些結果說明高頻率振動刺激更在利于骨形成。

加載間隔時間 Rolbing等人將每天360次循環載荷分為兩種加載組，一組中分4次，每次90次循環，另一組分6次，每次60次循環，結果發現都促進了骨形成效應［14］。需要指出的是，當增加力學加載的持續時間時，不但不會持續地增加骨量，反而骨形成響應會逐漸減弱，這可能是緣于細胞對力學刺激不再敏感了。但如果在加載周期之間增加一定的靜止時間，則骨組織細胞又會再度響應力學刺激。Robling等人在每次循環間增加14 s的靜止時間時，發現可以優化載荷引起的骨形成［15］。當他們在大鼠實驗中對載荷周期間給予4小時的靜止時間后，骨形成可增加1倍以上［16］。Lamothe和Zernicke的懸臂梁模型進一步證實這一結論，他們在施加總共時長為100 s頻率為30Hz的循環載荷時，每隔1 s加入10 s的靜止時間，這時總循環次數比不加靜止時間降低了90%，但骨形成卻增加72%［17］。以上研究結果說明，連續長時間加載并不利于骨形成，給予特定的間隔會幫助骨組織細胞再次獲得對力學刺激的敏感性。

加載率 應變幅值的增加或減少的速率對于成骨潛能具有決定性的影響。一項較早的研究使用了非侵入式的加載裝置，結果發現新骨形成量的變化主要依賴于應變率而非峰值應變的幅值［18］。另一項研究應用大鼠尺骨加載模型，施加了具有相同峰值應變和周期的動態載荷，但應變率由-0.018增加到-0.100 s-1，結果顯示其可以促進骨形成［19］。Turner等人已經發現增加載率可顯著促進成熟大鼠脛骨的骨形成［10］，同樣新骨形成的量與應變加載率呈正相關性。此結論與人類運動學的研究結果類似，例如進行高水平沖擊載荷訓練的運動（如壁球、網球、三級跳等）比那些較平衡的運動（如游泳和騎腳踏車等）更有利于新骨的形成，并增加更多的骨量［20］。目前關于加載率如何影響骨組織細胞的響應，進而調控骨重建的相關研究仍較少，因此加載率影響骨形成的機制仍不清楚。

3 流體剪切力

Piekarski和Munro于1977年最早提出力學載荷在骨內引起液體流動，但那時他們只是認識到這種流動對于運送營養和帶走代謝廢物是非常必要的［21］。從20世紀90年代末開始，人們開始關注骨內孔隙中液體流動對骨內細胞的影響［22］。雖然理論模型已經用于預測骨陷窩-骨小管中的流體剪切力，但實驗測定此種力的生理值仍較為困難。Wang等人發展了一種基于熒光漂白恢復的技術，可以利用激光共聚焦顯微鏡直接和實時地測量完整骨內的溶質的運動情況［23］。如果沒有外載，則這種方法可以得到熒光染料的擴散系數，并確定胞外基質的孔隙尺度。2011年Price等人將熒光漂白恢復方法與計算模型相結合，預測得到了周期載荷作用下的液體流速為60 με，流體剪切力峰值約為5 Pa［24］。

20世紀90年代的一批研究成果證明了骨細胞對流體刺激的敏感性。Klein-Nulend等首次證明骨細胞對流體剪切力的敏感性［25］，而流體剪切力的水平與Weinbaum的預測結果相符［26］。越來越多的證據表明細胞外間隙液體的流動對于骨組織細胞的激活具有關鍵作用。Weinbaum等人假設作用于骨細胞突的流體剪切力是引起細胞響應的初始信號，并發展了一個精細的多尺度模型［26］。他們假設骨細胞突周圍充滿了胞外基質，這種基質可以讓尺寸小于7 nm的分子通過，但會阻礙白蛋白等大分子。該理論預測，盡管骨的整體變形非常小，但由于胞外基質中空間尺度也較小（典型尺寸為100 nm），從而在骨細胞突的膜上產生的流體剪切力可達8至30 dyne/cm2，這與血管中內皮細胞周圍的流體剪切力水平相似。

4 壓力

骨組織細胞也會受到壓力作用，但大小在骨陷窩-骨小管系統、髓內等不同位置會有差異［27］。在骨陷窩-骨小管孔隙中產生的靜水壓力，其大小是骨組織軸向應力的12%，但比血管通道內壓力高近40倍［28］。當人們進行正常活動時，骨內靜水壓也是周期性變化的，振蕩峰值從0至18 MPa，頻率為1 Hz，并在骨陷窩-骨小管孔隙中產生0.27 MPa的流體壓力。靜水壓通常會使細胞體產生比細胞突更大的變形［29］，也有人建立了多孔彈性細胞模型研究了單個細胞周圍的局部變形［30］。

正常生理狀態下的靜水壓約為138 kPa，但足以抑制破骨細胞在骨髓中的形成［31］，而303 kPa的壓力可促進PGE2的產生，以及抑制成骨細胞中膠原的合成［32］。當對成骨細胞施加周期性靜水壓（0-68 kPa，1 Hz）或流體剪切力（1.2 Pa）時，可引起相似的ATP胞外釋放和COX-2表達［33］。Klein-Nulend等對骨細胞、成骨細胞施加周期性流體剪切力和靜水壓力，發現骨細胞對流體剪切力特別敏感［34］，但也有人質疑此項研究中所用的靜水壓力13 kPa遠小于在體情況下的5 MPa［35］。最近有人對MLO-Y4骨細胞施加68 kPa的周期性靜水壓力刺激，發現可以改變信號分子的傳導［36］。近些年的研究結果顯示，骨細胞更易感受骨內間隙液體的流動的刺激，而對流動電勢和靜水壓則并不敏感。

5 損傷

實際上，人們的正常活動所引起的骨應變是非常小的，不足以直接引起骨破壞。但如同其它材料一樣，長期的、周期性的力學載荷作用下，骨也會發生疲勞損傷，從而導致微觀裂紋的形成。在體情況下骨內微損傷是由Frost首次發現的［37］，并被許多研究所證實［38］。骨內微損傷可刺激引起骨重建，即啟動破骨細胞介導的骨吸收以及成骨細胞介導的骨形成過程［39］。在此過程中，首先破骨細胞向微損傷部位進行定向移動，以除去破壞的骨組織，隨后成骨細胞會在此部位產生新的骨。如果損傷累積的速度高呈骨組織修復，則微損傷會發展為大的微裂紋，并擴展形成應力斷裂。當骨廢用或過度使用時，骨細胞的凋亡會促進骨重建部位數目的增加［40］，而引起骨細胞死亡的原因可能包括微裂紋對骨細胞造成的損傷或廢用時骨細胞周圍對流的缺乏。

6 總結與展望

由本文綜述的近期研究結果可以看出，人們正在試圖在動物和細胞水平的實驗中區分不同力學刺激種類，即基質變形、振動、流體剪切力、壓力和損傷等，并研究了這些因素對于骨重建的影響。目前該方向的研究進展已經獲得了一些對臨床防治骨骼疾病具有啟發意義的結果。首先，人們已經通過實驗和理論證明了骨細胞周圍的力學刺激水平要遠高于組織水平的平均應變，從而可以解釋骨細胞參與力致骨重建的主要機制。進而，骨組織細胞會對振動刺激發生響應，并對頻率、加載間隔時間和加載率更為敏感，但細胞如何進一步調控骨重建目前仍不清楚。流體剪切力對成骨系骨組織細胞的促進作用已經研究得較為徹底，但對破骨細胞的研究則較少。骨組織細胞對于壓力的直接響應并不顯著，當然由于相關研究更多集中于在體水平，仍需更多細胞水平的實驗數據。已經證明骨內的微損傷可以介導定位骨重建，有理由相信損傷局部的某些化學物或力學微環境的梯度會參與破骨細胞的遷移和分化。

為了進一步明確骨組織細胞在不同力學刺激下對骨重建的貢獻，仍需發展更為先進的細胞力學實驗技術。雖然人們已經發展了很多對細胞進行力學刺激的實驗裝置，如用于模擬基質變形的基底拉伸裝置、模擬振動刺激的細胞培養振動臺、模擬流體剪切力的流動腔技術、靜水壓力裝置等，但各個實驗室所用的實驗裝置通常為自制，在細胞實際所受到的力學刺激參數上難以保證統一和準確。有些實驗裝置實際上是多種力學刺激的耦合，例如動態基底牽拉裝置也會產生液體的流動，不同培養液面的高度會對細胞產生不同水平的靜水壓；又如流動腔通常只控制壁面流體剪切力，而不會區分靜水壓。因此在實際裝置及力學刺激水平的精確控制上仍需要更為標準化和系統化的實驗方法設計。

在骨重建的細胞力學領域，目前仍有大量未解決的問題，例如破骨前體細胞如何遷移到骨吸收區的前端？微缺損的存在是否影響破骨單體細胞的整合？細胞水平的力致鈣響應在力致骨重建中扮演什么角色？顯而易見，細胞水平的實驗并不足以回答這些問題，需要開展在體研究。一個解決辦法是繼續發展在體3維熒光檢測技術，通過熒光染料來標識骨組織細胞的位置和細胞內部的蛋白分子和細胞周圍的溶質分子，這樣才可在施加外載荷的同時觀察復雜骨內結構中細胞的動態遷移和信號分子在骨內不同細胞間的傳遞。進一步結合基因轉染等分子生物學技術并開展動物實驗，就可以更為清晰地解釋不同力學微環境下細胞中的分子信號轉導通路，從而闡明Wolff定律的細胞/分子機制。

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Advances in cell mechanics of bone remodeling

HUO Bo， BAI Xue
School of Aerospace Engineering， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081

Since the late 19th century it has been recognized that bone structure can be adapted to external mechanical loading. The mechanotransduction of bone cells is aiming to clarify the cellular and molecular mechanism of mechanically stimulated bone remodeling. This review summarizes the advances on the biological response of bone cells under mechanical stimulations， especially analyses the effect of different mechanical microenvironments on bone remodeling such as matrix deformation， vibration， fluid shear stress， pressure and microdamage.

bone tissue； osteoporosis； mechanical microenvironment； mechanical stimulation； bone remodeling

R35

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.15

2015-07-29；

2015-07-31

國家自然科學基金（11372043， 30970707）

霍波，教授，研究方向為骨質疏松及細胞力學，電子信箱：huobo@bit.edu.cn

引用格式：霍波，白雪.骨結構重建的細胞力學研究進展［J］.世界復合醫學，2015，1（3）：272-276