三種主要食物過敏原蛋白及其結構分析

張　楠，布冠好，陳復生，朱婷偉（河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

三種主要食物過敏原蛋白及其結構分析

張楠，布冠好*，陳復生，朱婷偉
（河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

目前食物過敏已成為世界各地普遍存在的食品安全問題，但引起人體過敏的大多是食物蛋白。本文主要綜述了大豆、花生、牛乳三種主要食物過敏蛋白及其結構分析的研究進展，為開發低敏性食物制品提供依據。

食物過敏，蛋白結構，分析方法

近年來，食物過敏已經成為食品安全的主要問題。調查顯示世界上約有4%的人口對食物過敏［1］，也有資料顯示在西方發達國家，1%～2%的成人與5%～8%的兒童都存在食物過敏現象［2］。據報道顯示，已有160多種食物被確認為具有過敏原性，其中牛乳、雞蛋、魚、甲殼類、花生、大豆、堅果以及小麥是主要的過敏原來源［3］。兒童主要對雞蛋和牛乳過敏［4］，而成人主要對海鮮類食物過敏［5］。很多食物在加工過程中會引起食物過敏原結構的改變而影響其過敏原性。因此，食物主要蛋白過敏原結構的研究越發重要。

目前，應用于蛋白質結構分析的方法眾多，但在通常的食物過敏蛋白結構性能研究中，主要采用了包括紅外（IR）光譜、拉曼（Raman）光譜、圓二色譜（CD）、核磁共振（NMR）、電子顯微鏡（掃描電鏡SEM，透射電鏡）、示差掃描量熱法（DSC）、熱重分析（TGA）、動態力學分析（DMA）等一系列技術手段［6］。盡管檢測食物過敏原結構變化的方法眾多，但本文主要綜述了圓二色光譜法、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振、掃描電鏡、DSC法對大豆、花生、牛乳幾種主要過敏原蛋白結構的研究。

1　大豆蛋白過敏原及其結構特點

1.1大豆主要蛋白過敏原

大豆中能引起人和動物發生過敏反應的蛋白質被稱為大豆抗原，也稱為致敏因子。主要包括：大豆空泡蛋白、大豆疏水蛋白、大豆殼蛋白、大豆抑制蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子等。其中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是主要的致敏蛋白。

1.1.1大豆球蛋白大豆球蛋白是由不同亞基構成的六聚體蛋白，是11S球蛋白的主要成分，分子質量為350～360ku，含有3000個氨基酸殘基，成熟的大豆球蛋白由非共價鍵連接的六個亞基對組成，每對亞基的相對分子質量約60ku，由一個酸性A肽鏈（35～40ku）和一個堿性B肽鏈（22ku）通過二硫鍵連接而成。酸性亞基為A1、A2和A3，其等電點分別為pH5.15、5.40和4.75；堿性亞基主要為B1、B2和B3，它們的等電點分別是pH8.0、8.25和8.5［7］。在不同離子強度、不同的pH環境和不同熱處理條件下大豆球蛋白可解離為亞基、成分多肽和半分子形式，但是存在于天然狀態下的大豆球蛋白分子結構卻十分緊密，很難被酶催化和水解［8］。

1.1.2β-伴大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白現已被證實為一個三聚體蛋白，也稱7S蛋白，其分子質量在150～200ku之間，該三聚體的聚集和解聚與溶液pH和離子強度密切相關，它由α、β、a’3個亞基組成，它們的相對分子質量分別是67、50和71ku［9］。β-伴大豆球蛋白可在低溫條件下溶解，等電點pI分別為4.90、5.18、5.66～6.00［10］。目前，有研究將β-伴球蛋白的含量作為評價大豆蛋白營養價值的指標之一［11］。

1.2大豆主要過敏原的結構特點分析

大豆蛋白中常見的二級結構元件主要由α-螺旋方法，β-折疊和無規則卷曲。研究發現，檢測大豆過敏原二級結構的變化主要有CD色譜、紅外光譜、DSC、SEM等方法。目前有多人已對大豆及大豆制品復合物的結構作出了相關研究。Marcone等［12］運用CD色光譜測得大豆球蛋白的α-螺旋含量為16%，β-折疊含量為56%。Zhao等［13］通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）方法研究大豆中的7S和11S球蛋白的二級結構，發現兩種大豆球蛋白二級結構主要為β-折疊和β-轉角，7S中β-折疊含量為45.6%，β-轉角為35.9%；11S中β-折疊含量為47.3%，β-轉角為35.8%，其中的α-螺旋則可以忽略。Zhang等［14］通過采用電泳、CD、紫外、DSC等方法研究了在高壓條件下的大豆球蛋白的構象變化，發現大豆球蛋白會分解成亞單位，同時這些亞基的構象經過高壓加工已被改變。DSC結果分析表明，大豆球蛋白在400MPa的壓力下經過10min處理后已變性；CD結果分析則表明，大豆球蛋白在500MPa的壓力下經過10min處理后，一些α-螺旋和β-折疊結構的有序結構被破壞從而變成無規卷曲。段春紅等［15］利用電泳、SEM、FTIR，分析了大豆7S球蛋白及其不同水解度的堿性蛋白酶酶解產物的結構特征，FTIR的結果分析表明，7S球蛋白在酶法水解過程中各種構象所占的比例發生了很大的變化，其二級結構發生了不同程度的變化。由于大豆過敏蛋白成分復雜，同時大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白兩種主要致敏原組分會隨著外界環境條件的變化發生著解聚與再聚集，因此研究大豆蛋白構象狀況及變化規律極其重要。另外，許彩虹［16］通過FTIR、CD、紫外等研究了大豆7S球蛋白糖基化產物結構，FTIR、CD的分析結果均表明，蛋白質二級結構的β-折疊有部分轉化為α-螺旋或無規則卷曲結構，二級結構仍以β-結構為主。紫外光譜掃描分析，蛋白質在接入多糖鏈后，蛋白質肽鏈會展開，導致了一些位于分子內部氨基酸的暴露，紫外強度增強。這些都為未來大豆過敏蛋白及其制品結構的研究開辟了道路。

2　花生蛋白過敏原及其結構分析方法

2.1花生主要蛋白過敏原

花生中的過敏原主要是分子量在0.7～100ku之間的高度糖基化蛋白質，它們來自于不同的蛋白質家族［17］。有研究發現，花生過敏原蛋白有Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8和某種脂蛋白9種蛋白成分，其中Ara h1、Ara h2、Ara h3被認定為主要過敏原，它們可被90%以上對花生過敏的患者血清IgE所識別［18］。目前，對Ara h1、Ara h2、Ara h3這3種蛋白結構研究較多。

2.1.1Ara h1Ara h1占花生蛋白總量的12%～16%，是花生過敏原中含量最高的過敏蛋白，是一種分子量為63.5ku，等電點為4.55的糖蛋白，在天然狀態下以三聚體形式存在［17］。其熱穩定性強，耐酶解，不易消化，與豌豆蛋白的序列相似性為40%，是花生中致敏性較強的組分之一［19］。

2.1.2Ara h2Ara h2是一種含有172個氨基酸的蛋白，屬于2S白蛋白家族，分子量為17～20ku的同種異型蛋白，其pI值為5.2，占花生蛋白總量的10%左右［20］，也是花生蛋白的主要過敏原。

2.1.3Ara h3Ara h3是一種分子量為57ku的致敏糖蛋白，屬于cupin類型［17］，由氨基端結構域和羧基端結構域構成，這兩個結構域內各有一個保守的cupin折疊，其中cupin折疊結構是由2組反平行β折疊片、無規則環和1個α螺旋組成，Ara h3的62%～72%序列與大豆球蛋白相同［21］。

2.2結構分析方法研究進展

迄今為止，對花生主要過敏原蛋白及其糖基化產物結構的研究取得了較大進展，使其結構被更清楚地揭示。徐宏等［22］利用圓二色光譜和熒光光譜對花生蛋白的二級結構進行了研究，發現α螺旋的含量為45%，β折疊含量大于15%。胡純秋等［23］采用CD、ANS熒光探針結合紫外可見（UV-Vis）光譜等方法，在不同溫度和時間加熱花生過敏原Ara h2，CD色譜分析表明，Ara h2經熱處理后其二級結構發生變化，其α-螺旋比例有所降低，而β-折疊比例均有所升高；紫外光譜顯示，處理溫度在55℃以上，包埋在蛋白質分子內部的氨基酸殘基暴露出來，其紫外吸收值均升高。趙冠里［24］通過采用電泳、CD、紫外、DSC等方法研究花生過敏蛋白與多糖接枝后的構象變化，DSC結果表明，蛋白糖接枝前的熱變性溫度低于接枝反應產物的溫度；DC結果顯示，花生分離蛋白與葡聚糖的混合會引起花生蛋白中的α-螺旋和無規則卷曲結構略微的降低，而與此同時，花生蛋白中β-折疊所占二級結構的比例增加。另外，Liu等［25］利用電泳、CD、DSC等技術相結合研究了花生蛋白與葡聚糖糖基化后結構的變化，CD結果表明，反應過后花生蛋白的二級結構發生了變化，α-螺旋與無規卷曲數量減少，β-折疊比例增加，β-折疊無明顯變化。可見，花生過敏蛋白及加工過程結構的研究已較完善，為今后深入研究其結構，降低其抗原性提供基礎。

3　牛乳主要過敏原及其結構特點分析

3.1牛乳主要蛋白過敏原結構

牛乳過敏是由乳及乳制品中的蛋白過敏原所引發的一種變態反應，它是由IgE介導或非IgE介導的免疫反應，絕大多數的牛乳蛋白都具有潛在的致敏性，目前，普遍認為酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白是3種主要的過敏原［26-27］。

3.1.1酪蛋白酪蛋白（casein）在牛乳中占蛋白質總量的80%～82%，由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4種獨立的蛋白組成，含有人體8種必需氨基酸，是一種全價蛋白質（以酪蛋白膠束狀態存在，能夠為生物體生長發育提供必需的氨基酸［28］。其中，αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個過敏原蛋白，凡是對酪蛋白過敏的人，基本上會對αs1-酪蛋白過敏［29］。

3.1.2β-乳球蛋白β-乳球蛋白一般是二聚體，其每個單位為18ku，它是牛乳中主要乳清蛋白的成分，占乳清蛋白的50%，是牛乳中主要的致敏原，在體內易引發過敏反應，IgE介導的牛乳過敏病人大多對β-乳球蛋白過敏［30］。另外，β-乳球蛋白發生免疫反應需要一個完整的三級結構［31］。

3.1.3α-乳白蛋白α-乳白蛋白分子量為14ku，單體由123個氨基酸的球形蛋白組成，屬溶菌酶家族，占牛乳清蛋白的25%，含有4個二硫鍵，結構非常穩定。另外，在動物模型中，α-乳白蛋白中成環的肽段（60～80），S-S（91～96）是最主要的抗原部位［31-32］。

3.2結構分析研究

近幾十年來，隨著高新技術的發展，同時在前人提出的理論基礎之上，多人對牛乳過敏蛋白及其加工后結構的研究有了很大提高。楊同香等［33］利用Trp和ANS熒光質譜技術對牛奶酪蛋白結構進行了研究，發現低蛋白濃度對酪蛋白結構的變化影響不明顯。Kim等［34］采用CD色譜法研究，將天然β-乳球蛋白在80℃的中性環境下加熱5min，α-螺旋從原來的16%降低到12%，不規則卷曲的含量從38%增加到43%，從而可看出該乳蛋白二級結構的變化很小。Navarra等［35］運用FTIR技術研究了不同的金屬離子對β-乳球蛋白構象的影響，結果顯示，在較低溫度下鋅離子能促進β-乳球蛋白的聚合；同時銅離子的結合使β-乳球蛋白的二級結構發生了變化。Ashton等［36］運用拉曼光譜法研究了不同pH對α-乳白蛋白的結構影響，結果表明，當pH為6.5～4.6時，主要是β-折疊發生了較大變化；而pH為3.6～1.8時，α-螺旋、β-折疊、無規卷曲等二級結構均發生了變化，同時，側鏈上暴露于溶劑中的氨基酸殘基也發生了變化。國內研究方面，林花等［37］用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究牛血清白蛋白-葡聚糖的接枝改性，經染色得到反應體系生成了以共價結合的糖蛋白復合物，結構發生了變化。孫煒煒等［38］通過電泳、CD、紅外、SEM、內源熒光分析乳清蛋白與葡聚糖接枝改性，從電泳圖譜得知，兩者確實發生了以共價鍵形式結合為基礎的接枝反應，生成了分子量較大的物質。由圓二色譜分析可知，接枝產物的α-螺旋和β-轉角含量減少，β-折疊和無規則卷曲含量增加。FTIR分析結果表明，糖分子的共價接入導致羥基和碳氧鍵的吸收峰強度增加；酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶峰形的變化進一步說明蛋白質二級結構破壞。SEM圖譜顯示，接枝物中并未出現典型的球狀結構，而是以混亂的片狀結構形式出現。仁珊等［39］利用美拉德反應制備β-乳球蛋白與低聚異麥芽糖結合產物，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析得到結合物相對分子量為44ku，仍保持原有二聚體結構。以上研究對進一步探討牛乳蛋白結構、抗原性、過敏原性具有重要的指導意義。

4　展望

隨著食品安全問題日益成為廣大人民群眾關注的焦點，食物過敏原結構的研究變得越發重要。目前，有很多方法已廣泛應用于檢測食物過敏原加工后結構的變化，但由于每種方法都存在一定的局限性，這就對過敏原結構變化的研究提出了新的挑戰。同時，隨著各交叉學科的發展及研究的不斷深入，色光譜學技術與其他分析技術（如電泳、掃描電鏡）的聯用，在一定程度上促進了過敏原蛋白結構的研究。另外，在食物過敏原蛋白結構的研究中，發現有較少研究將一些相關的免疫學性質與過敏蛋白結構相對應，因此這一方向將會成為今后重要的研究課題，為進一步推動食物過敏原蛋白結構及其過敏原性降低的研究提供參考。

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Research on three major food allergens protein and its structures

ZHANG Nan，BU Guan-hao*，CHEN Fu-sheng，ZHU Ting-wei
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Food allergy had become a major safety issue concern worldwide，but human allergy mostly caused by food protein.The recent research progress on the structure of the major allergens in soybean，peanut，milk was focused in this paper.All of these information were useful on account of whey protein for producing hypoallergenic dairy products.

food allergy；protein structure；analysis

TS214.2

A

1002-0306（2015）02-0397-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.078

2014-05-12

張楠（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品蛋白質資源開發及利用。

布冠好（1980-），女，博士研究生，副教授，研究方向：食品蛋白質資源開發與利用。

國家自然科學基金項目（31201293，21176058，31171790）；國家863項目（2013AA102208-5）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（14B550013）。