多發(fā)性骨髓瘤患者 DAPK的表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

游崇登 何勤 劉琳 朱鴻斌 湯宏宇 張利娟 賀振新

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細胞的惡性腫瘤。是多發(fā)于老年患者的一種血液系統(tǒng)惡性疾病，其自然病程具有高度異質性，中位生存期為3～4年。隨著硼替佐米等蛋白酶體抑制劑及沙利度胺、雷利度胺等免疫調節(jié)劑的臨床應用，MM的完全緩解率(complete remission，CR)及總生存期(overall survival，OS)有了顯著提高，但復發(fā)、難治仍是臨床面臨的巨大難題，至今MM仍是一種無法治愈的疾病。DNA甲基化是血液腫瘤抑癌基因失活的常見機制。死亡相關蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)是Deiss等［1］在功能性基因克隆中首先發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其位于人類第9號染色體的q34.1，編碼序列全長4 293 bp，廣泛參與多種途徑介導的細胞凋亡。DAPK具有參與細胞凋亡、抑制細胞遷移等生物學功能。DAPK基因啟動子區(qū)甲基化對疾病的進展及預后影響不一。本文采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)及甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)技術，從DNA甲基化和基因表達的方面研究MM患者及對照組的骨髓單個核細胞中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率及其mRNA的表達水平，探討它們之間可能存在的關系及與臨床特征的相關性，并研究DAPK基因在MM發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月至2011年6月確診的54例多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標本為實驗組，標本來自昆明醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科和附屬第二醫(yī)院血液科，其中男35例，女19例;年齡38～79歲，平均年齡(63±9)歲，中位年齡64歲。包括初診患者27例，復發(fā)患者27例。Druie-Salmon分期:Ⅰ期A組2例，Ⅱ期A組16例，Ⅱ期B組4例，Ⅲ期A組19例，Ⅲ期B組13例。分型:lgG型26例，lgA型14例，未分泌型9例，輕鏈型5例。所有病例診斷均符合標準［2］。對照組為非血液腫瘤患者骨髓標本(主要為營養(yǎng)不良性性貧血和免疫性血小板減少癥患者)40例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器:DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒為杭州Axygen Bioscigens公司產品。EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，Zymo Taq PreMix TM Kit為美國ZYMO Research公司產品。TRIzol Reagent抽提液，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit等購自美國Invitrogen公司。PCR擴增儀，qPCR擴增儀和全自動凝膠圖像分析儀均為美國Bio-rad公司的產品。

引物設計目前通常選擇“MethPrimer”程序，對目的基因轉錄起始位點上游2 000 bp內CpG島位進行引物設計。“MethPrimer”設計程序默認的 CpG島跨度至少為200 bp，GC含量＞50%，CpG出現(xiàn)頻率＞0.6。因此，符合這些參數(shù)的區(qū)域都默認為 CpG島。我們可以根據(jù)任意1個CpG島設計引物進行擴增。本文的DAPK基因甲基化引物來自文獻［3］，由上海invitrogen公司合成引物，用去離子水溶解為25 μmol/L，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ姳?。

表1 MSP引物信息

1.2.2 標本的收集及處理:采集實驗組及對照組的骨髓標本，并進行骨髓單個核細胞(MNC)的分離，用PBS緩沖液稀釋細胞數(shù)至1×108/ml，分別分裝到去RNA酶的 Eppendorf管中，－80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MSP法檢測DAPK基因甲基化的狀態(tài):提取基因組DNA:基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾操作步驟按試劑盒說明書進行。MSP擴增:DAPK甲基化上游引物:5＇-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3＇，下游引物:5＇-CCCTCCCAAACGCCGA-3＇，擴增片段長度為98bp;非甲基化上游引物:5＇-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3 ＇，下 游 引 物:5 ＇-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3’，擴增片段長度為106 bp。引物參考外文文獻和引物設計軟件分析設計。PCR擴增反應:瓊脂糖凝膠電泳，經全自動凝膠圖像分析儀在紫外燈下顯影照相，根據(jù)特異性條帶的有無，分別記為陽性和陰性。

1.2.4 RT-PCR檢測 DAPK mRNA 的表達情況:①RT-qPCR反應體系。將提取的RNA用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit將其逆轉錄為cDNA保存。取 cDNA 4 μl，加入上下游引物各1 μl，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG 25 μl，加入 RNase-Free ＆DNase-Free ddH2O 19 μl，構成總體積50 μl的反應體系。在反應條件是50℃、95℃預變性各2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)，65～95℃溶解曲線1 min下進行PCR反應。實驗中以GAPDH作為內標基因，以標準化各個標本中DAPK基因相對表達量，以Hela及HEPG2為質控，以DAPK基因作為目的基因。②結果判定標準:反應的數(shù)據(jù)由Bio-Rad CFX軟件進行收集及分析。通過目的基因和內參基因拷貝數(shù)的比值進行樣本間相對定量的比較。所有數(shù)值以相對于GAPDH基因升高或減少的倍數(shù)(Fold)表示。所有標本的基因復制的數(shù)值均以閾值循環(huán)(Cycle threshold Ct)表達。具體如下:目的基因的表達量=2－△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因 －Ct內標基因)實驗組－(Ct目的基因 －Ct內標基因)對照組，表示的是實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可直接得到目的基因相對于內參基因組的定量。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，基因表達分析首先進行正態(tài)性檢驗，如果符合正態(tài)分布以±s表示，進行t檢驗;如果計量資料不符合正態(tài)分布，則以中位數(shù)±四分位數(shù)間距進行描述，采用秩和檢驗統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。在進一步做組間的兩兩比較，為了減少I類誤差，將原來的檢驗水準α=0.05調整為α=α/比較次數(shù)，即P≤α時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗組及對照組DAPK甲基化的表達情況 實驗中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率為18.52%(10/54);對照組DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率為0(0/40)。采用校正χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.500，P＜0.05)。見圖1、2。

圖1 部分實驗組樣本DAPK基因啟動子區(qū)甲基化電泳圖

圖2 部分對照組樣本DAPK基因啟動子區(qū)甲基化電泳圖

2.2 MM患者DAPK基因啟動子區(qū)甲基化與部分臨床特征的相關性 (1)性別:男性患者陽性率14.29%(5/35)，女性患者陽性率 26.32%(5/19)，χ2=0.518，P＞0.05。(2)年齡:≥65 歲者陽性率23.08%(6/26)，＜65 歲者陽性率 14.29%(4/28)，χ2=0.231，P＞0.05。(3)分期:Ⅰ + Ⅱ期者陽性率31.82%(7/22)，Ⅲ期者陽性率 9.38%(3/32)，χ2=2.992，P＞0.05。(4)分組:A 組者陽性率 21.62%(8/37)，B 組者陽性率13.33%(2/15)，χ2=0.089，P＞0.05。(5)是否初治:初治組者陽性率18.52%(5/27)，復發(fā)組陽性率18.52%(5/27)，χ2=0.000，P＞0.05。差異均無統(tǒng)計學意義(注:①～④校正χ2檢驗，⑤χ2檢驗)。

2.3 DAPK mRNA表達情況統(tǒng)計分析(目的與內參基因溶解曲線，溶解曲線為單一峰值，說明引物設計合理，可進行相對表達量的計算。見圖3、4。

圖3 DAPK mRNA溶解曲線

圖4 GADPH mRNA溶解曲線

2.3.1 M組和對照組DAPK基因mRNA比較:在MM組為(1.09 ±1.35)Fold，對照組為(1.26 ±1.38)Fold，采用 Wilcoxon 兩樣本比較法，Z= －1.579，P＞0.05。

2.3.2 甲基化組、非甲基化組、對照組3組間兩兩比較:①甲基化組與非甲基化組:(0.76±1.09)Fold VS(1.18 ±1.28)Fold，Z= －1.414，P＞0.0167。②甲基化組與對照組:(0.76 ±1.09)Fold VS(1.26 ±1.38)Fold，Z= －2.292，P＞0.0167。③非甲基化組與對照組:(1.18 ±1.28)Fold VS(1.26 ±1.38)Fold，Z=－1.003，P＞0.0167。

2.3.3 初診組、復發(fā)組、對照組3組間兩兩比較:①初診組與復發(fā)組:(0.98 ±1.19)Fold VS(1.17 ±1.72)Fold，Z= －0.978，P＞0.0167。②初診組與對照組(0.98 ± 1.19)Fold VS(1.26 ± 1.38)Fold，Z=－2.045，P＞0.0167。③復發(fā)組與對照組:(1.17 ±1.72)FoldVS(1.26 ± 1.38)Fold，Z= － 0.588，P＞0.0167。

2.4 DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性標本測序結果分析 將本實驗表達DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性的標本送上海Invitrogen公司進行測序，測序結果運用DNAstar軟件進行拼接，再用BIQ analyzer軟件進行分析，如果甲基化擴增產物測序結果與非甲基化擴增產物測序結果對比見C→T，則證明該樣本確實存在DAPK基因啟動子區(qū)甲基化。經測序證實10例DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性標本確實存在甲基化。這兩者比較從圖中可見有10處基因位點從C→T，提示該標本確實存在DAPK基因啟動子區(qū)的甲基化。見圖5。

圖5 1例送檢MM樣本中DAPK基因甲基化擴增產物(橙色標記)與非甲基化擴增產物(紫色標記)序列對比圖

2.5 DAPK基因mRNA在實驗組和對照組中的表達情況 采用Wilcoxon兩樣本比較法，對所得的數(shù)據(jù)進行分析，得 Z值 －1.579，P=0.114;DAPK 基因 mRNA 在 MM 組為(1.09 ±1.35)Fold，對照組為(1.26 ±1.38)Fold，實驗組與對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明DAPK基因mRNA的表達水平在MM組和對照組無差異。

54例MM患者中，根據(jù)DAPK基因啟動子區(qū)甲基化情況，可分為甲基化組、非甲基化組。采用Kruskal-Wallis法對 3組數(shù)據(jù)進行分析得，χ2=0.859，P=0.088，P＞0.05，表明3組之間 DAPK 基因 mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義。對這3組進行組間兩兩比較時，應調整檢驗水準(0.5/3≈0.0167)，即P＜0.0167時，差異有統(tǒng)計學意義，結果顯示三者的P值均＞0.0167，表明在甲基化組、非甲基化組及對照組中DAPK基因mRNA表達水平無差異。

54例MM患者中，根據(jù)是否接受治療，可分為初診組和復發(fā)組。采用Kruskal-Wallis法對3組數(shù)據(jù)進行分析得 χ2=3.764，P=0.152，表明 3 組之間 DAPK基因mRNA表達水平相比較，無顯著性差異。對這3組進行組間兩兩比較時，應調整檢驗水準(0.5/3≈0.0167)，即P＜0.0167時，差異有統(tǒng)計學意義，結果顯示三者的P值均＞0.0167，即初診組、復發(fā)組及對照組中DAPK基因mRNA表達水平無差異。

3 討論

DAPK基因是一種鈣離子與鈣調素依賴的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，是IFN-γ介導的正性細胞凋亡促進因子，廣泛參與多種途徑介導的細胞凋亡。近年來，DAPK基因啟動子區(qū)甲基化與腫瘤的關系倍受關注，已在宮頸癌、結腸癌組、肝細胞癌等多種實體腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動子區(qū)域CpG島高頻率甲基化。有研究發(fā)現(xiàn)，DAPK表達缺失的垂體腺瘤往往更具有侵襲性，乳腺癌中DAPK表達減少與患者的生存期成負相關，與腫瘤的復發(fā)成正相關［3］。DAPK啟動子區(qū)高甲基化致DAPK缺失已證實在B細胞惡性腫瘤如濾泡性淋巴瘤、彌漫大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤中為常見現(xiàn)象［4］。研究發(fā)現(xiàn)在MM中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率在 5.9% ～30%［5－7］，本研究中MM患者DAPK基因啟動子區(qū)甲基化的陽性率為18.52%(10/54)，與報道的陽性率較接近;而40例對照組中甲基化陽性率為0(0/40)，提示DAPK基因啟動子區(qū)甲基化在MM的發(fā)病中具有一定的作用。

Eleftheria等［8］研究發(fā)現(xiàn)，DAPK基因在 MM 中甲基化的陽性率雖不高(4/68)，但與預后不良的指標如高肌酐水平、高鈣、分期為Ⅲ期等顯著相關，總生存期明顯低于陰性患者。本研究發(fā)現(xiàn)，DAPK基因啟動子區(qū)在MM中的高甲基化與MM患者的某些臨床特征存在一定的相關性:(1)與分期的關系:Ⅰ期和Ⅱ期的甲基化陽性率為31.82%(7/22)、Ⅲ期的甲基化陽性率為9.38%(3/32)，Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期相比，DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率差異無統(tǒng)計意義，提示DAPK基因啟動子區(qū)甲基化可能是MM發(fā)病的早期事件，這與Ng等［9］的實驗結果一致。(2)與分型的關系:IgG型MM的DAPK基因啟動子區(qū)甲基化的陽性率明顯高于對照組(P＜0.01)，這進一步表明DAPK基因啟動子區(qū)甲基化參與了MM的發(fā)生發(fā)展。(3)與性別和年齡的關系:DAPK基因啟動子區(qū)甲基化的陽性率與性別和年齡無關。(4)與治療的關系:在初診組和復發(fā)組中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率都為18.52%(5/27)，兩者差異無統(tǒng)計學意義，初步表明DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性狀態(tài)與治療無關，但亦可能是因為樣本量較少、患者接受治療的不均一性和傳統(tǒng)治療藥物很少具有逆轉甲基化作用等有關，應進一步擴大樣本進行研究。

同時MM患者的DAPK基因mRNA表達量低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，考慮與樣本量不足有關;DAPK基因mRNA表達量甲基化組低于非甲基化組及對照組，與基因甲基化使基因表達沉默理論相符，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.0167)，考慮其原因與樣本較少有關。初診組和復發(fā)組中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率相同，而初診組的DAPK基因mRNA表達量低于復診組和對照組，雖然差異也無統(tǒng)計學意義(P＞0.01)，但考慮到基因甲基化并非是基因表達沉默的唯一機制，國外Raveh等［10－12］研究也提示除啟動子高度甲基化是DAPK基因在人類腫瘤中失活的主要機制外，可能還同時存在其他機制導致該基因表達沉默，如基因雜合缺失［10］、基因純合缺失［11，12］。需進一步擴大樣本量進行研究證實。

綜上所述，DAPK基因作為與細胞周期調控有關的重要抑癌基因，其甲基化的異常在多發(fā)性骨髓瘤中確實存在，MSP方法靈敏性高，因此使用MSP方法檢測DAPK基因的甲基化狀態(tài)將有可能成為檢測MM微小殘留病的一個指標［13］，去甲基化的藥物可能是一種有效的治療方法［14］。

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