脂酰苯丙氨酸甲酯同系凝膠因子的合成及凝膠性質考察

王曉明 秦凌浩 吳進銳 胡巧紅

自組裝超分子凝膠是一類通過凝膠因子分子間相互作用而形成的新型凝膠體系。在該體系中，凝膠因子主要通過分子間氫鍵、π-π堆積、范德華力、疏水作用力等非共價鍵相互作用以特定的分子構型排列，當體系溫度降至凝膠相變溫度以下時，自發聚集組裝形成線狀、纖維狀超分子結構，進而相互纏繞形成三維網絡結構，這種結構可以使大部分中等極性和非極性的溶劑凝膠化，使體系由液體轉變為半固體凝膠［1－5］。這種超分子凝膠具有無毒、無組織刺激性、生物相容性的優點，可使藥物達到長效緩釋的作用，并且可避免傳統原位凝膠作為藥物載體時產生的突釋、組織刺激性等副作用以及高分子材料降解產物對藥物穩定性的影響［6］。近年來這種超分子凝膠作為藥物緩釋載體受到越來越多的關注。本文選擇苯丙氨酸甲酯為起始原料，通過與肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯反應，合成一系列可生物降解的脂酰苯丙氨酸凝膠因子，對該類凝膠因子的結構進行表征，并對其凝膠化性質進行考察，為其作為長效釋藥載體提供必要的研究基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Spectrum100傅立葉變換紅外光譜儀(PerkinElmer)，AV-500MHz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司)，micro TOF-Q飛行時間質譜儀(德國Bruker公司)，X-6顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)，85-2恒溫磁力攪拌器(常州澳華儀器有限公司)，9240MBE電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)，HH-S數顯恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)。

1.2 材料 L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(上海凱賽化工有限公司)，肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯(無錫貝諾精細化工有限公司)，一級大豆油(廣州糧油工業有限公司)，三乙胺(天津市富宇精細化工有限公司)，三氯甲烷(衡陽市凱倍化工試劑有限公司)，丙酮、鹽酸(廣州化學試劑廠)，無水硫酸鎂(天津市百世化工有限公司)，碳酸氫鈉、氯化鈉(廣州市金華大化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 凝膠因子的合成 以苯丙氨酸甲酯為母核，肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯為酰化劑，通過氮酰化反應形成酰胺，制得 C14-L-Phe-OMe、C16-L-Phe-OMe、C18-L-Phe-OMe，反應式如圖1。

圖1 脂酰苯丙氨酸凝膠因子的反應式

［6］方法，精密稱取L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(0.065 ～0.075 mol)，置于 250 ml三頸瓶中，加入三氯甲烷100 ml，密閉，于攪拌條件下加入三乙胺(0.13 ～0.15 mol)，繼續攪拌30 min。精密稱取肉豆蔻酰氯(0.055～0.065 mol)，與適量三氯甲烷混勻后，緩慢滴加到上述三頸瓶中，于氮氣保護下回流反應過夜。反應結束后，依次用蒸餾水、飽和NaCl溶液、飽和NaHCO3溶液、1 mol/L鹽酸溶液及蒸餾水洗滌萃取，收集有機層并加入一定量的無水MgSO4靜置約2 h，進行干燥。干燥后過濾，濾液置通風櫥中揮干，得白色粗品，再加入適量的丙酮重結晶，揮干溶劑后得白色針狀固體即為 C14-L-Phe-OMe。C16-L-Phe-OMe、C18-LPhe-OMe同樣按上述方法進行合成，分別得到白色針狀固體和白色塊狀固體。最終三種凝膠因子的產率分別為:51.5%、73.4%、52.6%。

2.2 凝膠因子的結構確證 將上述三種同系物凝膠因子通過IR、1H-NMR、MS進行結構表征。由圖可知:(1)IR圖譜(KBr壓片法)中出現特征峰:3 339.08·cm－1(υNH)、1 648.60 cm－1(υC=O)、1 528.67 cm－1(βNH)、1 265.75 cm－1(υC-N);(2)1H-NMR 圖 譜(500 Hz，MeOD)中出現以下特征峰:0.882 ～0.909(t，3H，CH3)、1.285 ～ 1.512(m，30H，CH2)、3.298 ～3.311(m，3H，COOCH3)、3.655 ～ 3.685(m，1H，ARCH2CHNHCO)、4.888(s，1H，NH)、7.191 ～ 7.280(m，5H，ArH);(3)MS圖譜(CHCl3)［M+Na］+中出現質子信號:m/z 440.3066。根據 IR、1H-NMR、MS 圖譜可以認定，所得產物為目標產物。見圖2～4。

圖2 C16-L-Phe-OMe的紅外光譜圖

圖3 C16-L-Phe-OMe在MeOD中的1H-NMR譜(500 MHz)

圖4 C16-L-Phe-OMe的質譜圖

2.3 熔點測定 用X-6顯微熔點測定儀測定C14-LPhe-OMe、C16-L-Phe-OMe、C18-L-Phe-OMe 的熔點。程序設定從25℃開始升溫，升溫速度為1℃/min，通過儀器放大鏡觀察樣品熔融情況，連續測定3次。見表1。

表1 3種凝膠因子的熔程

2.4 相轉變溫度的測定參考文獻［7］方法，測定三種凝膠因子在一級大豆油中的溶膠-凝膠轉變溫度(θSG)和凝膠-溶膠轉變溫度(θGS)。

2.4.1 溶膠-凝膠轉變溫度(θSG)的測定:在試管中分別配制一系列不同質量濃度的三種凝膠因子的一級大豆油溶液。將試管置于恒溫水浴中，采用反置試管法測定其θSG。即從50℃開始，恒溫15 min后將試管倒置，若有液體流動，則判定其未形成凝膠，若無液體流動，則判定已形成凝膠，凝膠溫度為當前溫度與上一溫度的中間值。降溫速率為2℃/min，每次降溫后均恒溫15 min，再將其倒置。依此類推，測定所有質量濃度溶液的θSG。當質量濃度低于300 g/L時，三種凝膠因子在一級大豆油中的θSG均未達到體溫37℃;當質量濃度達到300 g/L時，C16-L-Phe-OMe的 θSG達到了37℃。由此可見，C16-L-Phe-OMe的膠凝能力最強。見圖5。

圖5 不同濃度的各種凝膠因子在一級大豆油中的θGS(n=3)

2.4.2 凝膠-溶膠轉變溫度(θGS)的測定:在試管中分別制備一系列不同質量濃度的三種凝膠因子的一級大豆油凝膠。將試管置于恒溫水浴中，采用反置試管法測定其θGS溫度。即從0℃開始，恒溫15 min后將試管倒置，若有液體流動，則判定其未形成凝膠，若無液體流動，則判定已形成凝膠，凝膠溫度為當前溫度與上一溫度的中間值。升溫速率為2℃/min，每次升溫后均恒溫15 min，再將其倒置。依此類推，測定所有質量濃度凝膠的θGS。當質量濃度為100 g/L時，三種凝膠因子的θGS均未達到37℃，200 g/L時，C16-L-Phe-OMe和C18-L-Phe-OMe的 θGS達到37℃，而在300 g/L時，所有凝膠因子的θGS都達到37℃。同一質量濃度下，C16-L-Phe-OMe 的 θGS最高，C14-L-Phe-OMe 的 θGS最低，說明三種凝膠因子的膠凝能力大小順序是:C16-L-Phe-OMe＞C18-L-Phe-OMe＞C14-L-Phe-OMe。見圖6。

圖6 不同濃度的各種凝膠因子在一級大豆油中的θGS(n=3)

2.5 凝膠因子碳鏈長度對成膠性能的影響 精密量取一級大豆油1 ml，置于具塞試管中，加入凝膠因子適量，于70℃下加熱至完全溶解。待溶液冷卻至37℃，將各試管倒置，若無液體沿試管壁流下，說明已形成凝膠，則加入適量油，重復上述步驟;若未形成凝膠，則加入適量的凝膠因子，重復上述步驟。以此類推，平行測定3份，最終測得三種凝膠因子在一級大豆油的最低膠凝濃度(mininal gelatin concentration，MGC)，以考察同系物中不同碳鏈長度對溶劑成膠能力的影響。C16-L-Phe-OMe的最低膠凝濃度最小，其膠凝能力最強。見表2。

表2 37℃時凝膠因子在一級大豆油中的最低膠凝濃度 g/ml

2.6 凝膠因子在不同溫度時的膠凝性能考察 分別測定 C14-L-Phe-OMe、C16-L-Phe-OMe和 C18-L-Phe-OMe在37℃、40℃、45℃、50℃、55℃時在一級大豆油中的最低膠凝濃度。對于超分子凝膠體系，其凝膠因子濃度的對數值(lnC)和凝膠相變溫度的倒數TGS－1呈線性關系并符合以下公式:

其中C為凝膠因子濃度，ΔH為凝膠-溶膠相變過程的焓變，TGS為凝膠-溶膠相變溫度，R為氣體常數。根據不同溫度下三種凝膠因子的濃度求出上述方程，并進一步對焓變進行分析。見表3。

表3 3種凝膠因子的焓變

3 討論

本文合成了三種可生物降解的脂酰苯丙氨酸甲酯同系凝膠因子，并確證了其結構，考察了其在一級大豆油中的膠凝特性及成膠能力。結果表明，該系列凝膠因子具有很好的成膠性能。此外，相轉變溫度、最低膠凝濃度及膠凝焓變的結果均表明，C16-L-Phe-OMe的膠凝能力最強。碳鏈較長的C18-L-Phe-OMe的最低膠凝濃度反而要高于C16-L-Phe-OMe，說明碳鏈的長度與凝膠因子的凝膠性能并非持續正相關。

本課題組前期合成了十四酰丙氨酸甲酯、十六酰丙氨酸甲酯、十八酰丙氨酸甲酯三種同系凝膠因子，并測得其在大豆油中的凝膠相變熱焓 ΔH分別為74.74 kJ/mol、51.70 kJ/mol和 61.61 kJ/mol，說明十六酰丙氨酸甲酯的膠凝能力最強［8］。也得出與本文一致的“碳鏈長度與凝膠因子的凝膠性能并非持續正相關”的結論。本結果可以看出，當碳鏈長度為14、16時，由于苯環的存在使得凝膠因子的相變熱焓明顯降低，說明同一溫度下，破壞不含苯環的凝膠因子所形成的凝膠要比破壞含有苯環的凝膠因子所形成的凝膠需要更多能量，預示著苯環的存在所造成的空間位阻或許對氫鍵效應有所影響;而當碳鏈長度達到18時，苯環對凝膠因子的成膠特性幾乎無影響。

本文合成的一系列脂酰苯丙氨酸凝膠因子中，相同質量濃度下，C16-L-Phe-OMe的相轉變溫度最容易達到37℃;熔程范圍最窄，純度最高;最低膠凝濃度最小，膠凝能力最強，有望作為一種局部給藥的長效釋藥載體。

參考文獻

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