姜黃素對局灶缺血再灌注損傷小鼠學習記憶功能及caspase-8的影響

李焰 劉鳳麗 王培培 左慧敏 程冉冉 周燕 李芬

腦缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病和多發病。腦缺血損傷所涉及的病理生理機制十分復雜，研究發現，在腦缺血后的幾個小時內，缺血半暗帶或梗死區周圍的神經元死亡主要以凋亡性死亡為主。姜黃素具有抗氧化、抗炎、調節神經遞質和受體等作用［1，2］。同時姜黃素在缺血性損傷中的作用越來越得到大家的認可，在前期工作中，我們進行了線粒體凋亡通路中Bcl2及Bax相關因子表達變化影響的研究［3］，目前此領域內鮮有對外源性凋亡通路相關因子進行實驗研究的報道，本研究采用小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察姜黃素對缺血再灌注損傷小鼠的caspase-8蛋白表達以及學習記憶功能的影響，從凋亡信號轉導通路方面深入探討姜黃素對小鼠局灶缺血再灌注損傷神經細胞的保護作用的可能分子機制，為臨床神經細胞保護新藥的開發提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 131只健康雄性昆明小鼠，動物合格證號 SCXK(京)(2007-0001)，清潔級(SPF)，體重28～32 g，由河北工程大學醫學院實驗動物中心提供。術前在22～25℃實驗室中飼養12 d以適應實驗室環境。動物隨機分為A組:假手術組20只;B組:缺血再灌組［I/R+0.9%氯化鈉溶液(NS)］57只;C組:姜黃素治療組54只;治療組于腦缺血前1 h腹腔給予20 mg/kg姜黃素。

1.2 主要試劑 姜黃素購自美國sigma公司，用二甲基亞砜溶解配置10 mg/ml儲存液，避光于4℃冰箱保存;Caspase-8兔抗鼠多克隆抗體(Santa cruz biotechnology，Inc)。水迷宮(北京碩林苑科技有限公司);圖像采集及圖像分析系統(Bio-Rad公司)。TUNEL試劑盒(Roche)。

1.3 動物模型的制備 本實驗采用線栓法制備MCAO局灶性腦缺血再灌注模型。將頭端涂有適量硅膠的6-0單尼龍線自小鼠右側頸外動脈向頸內動脈插入，至大腦中動脈與大腦前動脈分叉處(插入深度約為11 mm)，阻塞大腦中動脈血流，造成右側大腦中動脈所轄區缺血。模型成功標準為出現神經功能缺損狀態，如不能完全伸展對側前爪，行走時向左側轉圈，成追尾狀，站立不穩，向對側(左側)傾倒等。

1.4 腦梗死灶的測定 再灌注24 h后，小鼠斷頭取腦，續冠狀切成2 mm厚的腦片，于2%TTC中染色30 min，4%多聚甲醛固定2 h以上。計算機圖像處理系統測量每一腦切片尾側面的梗塞面積，將各腦切片的梗塞面積乘以2 mm(腦片厚度)再相加，既為梗死灶體積。

1.5 學習和記憶功能測試 為避免小鼠腦損傷后運動功能障礙對水迷宮測試結果的影響，3組分別于傷后第7、8、9及10天進行Morris水迷宮測試。實驗時，將安全島隨機置于水迷宮四個象限(N、S、E、W)中的任一象限，加水(奶粉沖呈乳白色)至高過安全島10 mm，水溫保持在22～25℃，由攝象機及計算機自動跟蹤、拍攝和統計大鼠分別由其他3個象限入水后尋找到安全島的軌跡和潛伏值。如在180 s內未找到安全島，則潛伏期值記為180 s。

1.6 免疫組織化學染色及TUNEL檢測 用40 g/L多聚甲醛將小鼠進行大循環灌流固定后，端頭取腦，于視交叉前后2 mm處選取頂葉腦組織，于40 g/L多聚甲醛中后固定24 h。常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，石蠟連續冠狀切片，厚5 μm，行免疫組織化學染色，一抗采用兔抗鼠多克隆抗體，陰性對照用PBS(0.01 mol/L，pH 值7.3)代替一抗孵育，根據免疫組織化學試劑盒進行操作，DAB試劑盒進行顯色，細胞核用蘇木素復染。細胞凋亡TUNLE檢測步驟同說明書。光鏡下神經元胞漿或胞核中有棕黃色顆粒的為陽性細胞。每張切片于梗死灶周圍缺血側皮層隨機選擇10個具有代表性的相互非重疊高倍視野(×400)，計算陽性細胞數，取平均值，進行半定量分析。

1.7 western blotting 檢測caspase-8蛋白表達 將小鼠端頭，取右側皮質，每100毫克組織樣本加入1ml裂解液，低溫下組織勻漿12 000 r/min，10 min，離心后取上清液。蛋白變性后加樣于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干法轉至硝酸纖維素膜，牛血清蛋白(BSA)封閉，加一抗兔抗鼠caspase-8、內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)4℃過夜，TBST(Tris堿 2.42 g，氯化鈉8.00 g，吐溫 20 ml，雙蒸水定容至 1 000 ml，調節 pH值至7.5)洗滌3次，每次5 min，加堿性磷酸酶藕連的羊抗兔IgG，37℃ 2 h，TBST洗滌3次，加入顯色液對甲苯胺藍/氯化硝基四氮唑藍，避光顯色，至出現條帶后用雙蒸水終止反應。

1.8 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，相關性采用pearson方法兩兩相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼠腦大體形態及TTC染色結果 缺血后缺血側鼠腦腫脹，有明確的梗死灶形成，TTC染色正常腦組織呈紅色，缺血灶呈蒼白色，缺血灶與大腦中動脈分布區域一致，證實模型制作成功，應用姜黃素后可見明顯縮小的梗死灶。見圖1。

圖1 TTC染色梗死體積

2.2 3組小鼠學習和記憶功能比較 B組第9天(P＜0.01)及第10天(P＜0.01)搜索安全島潛伏期較A組明顯延長。C組第9天(P＜0.01)及第10天(P＜0.01)搜索安全島潛伏期較B組明顯縮短。見圖2。

圖2 3組小鼠水迷宮實驗比較

2.3 caspase-8免疫組織化學觀察 caspase-8產物為棕黃色顆粒，定位于神經元胞質。與A組比較，B組3 h后缺血半球半影區皮質caspase-8表達增加，12 h達高峰，24 h逐漸降低，72 h降至A組水平并持續。與B組比較，在缺血半球半影區皮質C組中caspase-8在12 h、24 h、48 h 顯著回降(P＜0.05)。見圖 3，表1。

圖3 再灌注12 h后3組小鼠皮質區caspase-免疫組化比較

表1 3組caspase-表達的陽性細胞數比較±s

表1 3組caspase-表達的陽性細胞數比較±s

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與B 組比較，#P ＜0.05

30 min 3 h 12 h 24 h 48 h 72 h A 組 4.25 ±1.21 4.01 ±1.23 3.78 ±1.22 3.88 ±1.61 4.2組別1 ±1.38 4.26 ±1.52 B 組 5.21 ±1.32 12.21 ±1.56* 32.42 ±1.78* 12.89 ±1.87* 10.36 ±1.65* 4.26 ±1.52 C 組 6.02 ±1.57 11.31 ±1.43* 16.32 ±1.43*# 7.32 ±1.72*# 5.54 ±1.83#5.51 ±1.67

2.4 western blotting檢測 caspase-8蛋白表達 caspase-8動態表達規律與免疫組織化學檢測結果相符，B組與A組比較，caspase-8在再灌后3 h、12 h、24 h、48 h顯著增高(P＜0.05)。C組與B組相比caspase-8 在3 h、12 h、24 h 顯著回降(P＜0.05)。見圖4。

圖4 B組和C組caspase-8免疫的蛋白表達

2.5 細胞凋亡檢測結果 凋亡神經細胞表現胞質濃縮，染色質凝集，核深染，呈深棕色顆粒狀。B組與A組比較，傷后3 h TUNEL陽性細胞開始顯著增加(P＜0.05)，隨著時間推移陽性細胞表達逐漸增多，傷后48 h達高峰(P＜0.05)。C組TUNEL陽性細胞各時相表達與模型組相似，但TUNEL陽性細胞數明顯減少，C 組與 B 組比較，12 h、24 h、48 h(P＜0.05)。見表2。

表2 3組凋亡細胞數比較±s

表2 3組凋亡細胞數比較±s

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，#P ＜0.05

組別30 min 3 h 12 h 24 h 48 h 72 h A 組 1.42 ±0.28 1.41 ±0.34 1.38 ±0.22 1.47 ±0.35 1.57 ±0.24 1.50 ±0.15 B 組 1.77 ±0.46 8.92 ±1.66* 12.22 ±1.57* 18.22 ±1.07* 25.05 ±2.20* 16.05 ±1.80*C 組 1.83 ±0.35 6.60 ±1.20* 6.03 ±2.11*# 10.56 ±2.20*# 12.10 ±12.10*#15.10 ±1.40*

3 討論

缺血性腦血管疾病發病率高、死亡率高、致殘率高及復發率高的特點，嚴重危害了人類的健康和生命。近幾十年的研究發現，在腦缺血后的幾個小時內，缺血半暗帶或梗死區周圍的神經元死亡主要以凋亡性死亡為主。也就是說腦缺血損傷與細胞凋亡的關系非常密切，因此腦缺血后神經細胞凋亡機制的探索以及基于抗凋亡為靶點的抗腦缺血藥物的研發亦成為研究的熱點。姜黃素是從姜黃中提取的酚性色素，姜黃素的保護性作用已在心肌及全腦缺血的動物實驗中得到證實，其具體機制也呈現多樣化的特點。已發現其具有抗炎、抗氧化、調脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應小［4］，但其對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制不祥。本室前期工作已證實姜黃素對小鼠局灶缺血再灌注有一定的保護作用［3］，為了更深入探討其抗凋亡機制本實驗從外源性凋亡通路加以探討，以其為臨床新藥的開發提供堅實的理論基礎。

目前，一般認為參與缺血性腦損傷細胞凋亡調控的有三條信號轉導通路，分別是線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路［5］。死亡受體通路即外源性細胞凋亡通路，TNF-α或Fas與死亡受體結合后，誘導死亡受體發生寡聚化，形成死亡誘導信號復合體(death inducing signaling complex，DISC)，導致 Caspase-8 激活。研究證實caspase-8是關鍵的啟動型caspase，其可通過特殊的細胞信號途徑導致caspase-3激活，將凋亡信號傳至caspase-3，caspase-3活化物能裂解DNA修復酶，使細胞不可逆地發生凋亡改變，包括核濃縮和DNA斷裂，最終導致細胞凋亡［6］。在我們的研究中TTC染色結果顯示，C組與B組相比較梗死體積顯著縮小，小鼠搜索安全島潛伏期明顯縮短，進一步說明姜黃素在小鼠腦缺血再灌注模型中一定程度上減輕了腦損傷和改善了學習記憶功能，與文獻報道［7］一致。Taoufik等［8］研究在永久性腦缺血模型中發現Caspase-8促進了神經細胞凋亡。為了證實姜黃素是否對外源性凋亡通路起作用，我們對Caspase-8進行了觀測，免疫組化及免疫印跡結果顯示:假手術組腦組織內Caspase-8表達水平極低，主要表達在神經元的胞漿內。在小鼠腦缺血再灌后3 h，大腦皮層Caspase-8蛋白表達開始增加，并于傷后12 h達到高峰。而凋亡細胞檢測高峰期出現在傷后48 h，Caspase-8的表達早于凋亡細胞的表達，同時二者的空間表達具有較強的一致性，統計學分析二者的時間變化趨勢具有平行性。提示:Caspase-8參與了局灶性腦缺血后的凋亡過程［9］，加重了缺血再灌注損傷。與模型組比較，免疫組化及免疫印跡結果均表明姜黃素可顯著減少各對應時相點Caspase-8的表達。同時相關分析結果提示Caspase-8陽性細胞數與TUNEL陽性細胞數呈正相關趨勢(r=0.794，P＜0.01)。所以我們推測姜黃素的神經保護機制之一為:減少Caspase-8的表達，從而減輕細胞凋亡而發揮神經保護作用。

1 Londeau N，Laur Itzen I，Widmann C，et al.A potent protective role of lysopholipida against global cerebral ischemia and glutamate excitotoxitity in neuronal cultures.Cereb Blood Flow Metab，2002，22:821-834.

2 雷軍榮，秦軍，張晶.姜黃素對大鼠缺血性腦損傷炎癥反應和血腦屏障通透性的影響.中國藥理學通報，2010，26:120-123.

3 李焰，程冉冉，周燕，等.姜黃素對小鼠腦缺血再灌注的腦組織中NO含量和Bcl-2、Bax表達的影響.職業與健康2012，28:1157-1159.

4 諶輝，張景輝，劉文琪.姜黃素抗血吸蟲病肝纖維化及其機制的實驗研究.中草藥，2009，40:1274-1277.

5 吳坤，趙艷，于衛平.細胞凋亡的研究進展.國外醫學遺傳學分冊，2001，24:134-138.

6 Ferre I，Planas AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra.Neuropatho Exp Neurol，2003，62:329-339.

7 Lei J R，Qin J，Zhang J，et al.Effects of curcumin on inflammatory reaction and blood-brain barrier permeability in rats following cerebral ischemic injury.Chin Pharmacol Bull，2010，26:120-123.

8 Taoufik E，Valable S，Müller GJ，et al.FLIP(L)protects neurons against in vivo ischemia and invitro glucose deprivation-induced cell death.J Neurosci，2007，27:6633-6646.

9 Vikas Kaushal，Lyanne C.Schlichter.Mechanisms of microglia-mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra.Neuroscience，2008，28:2221-2230.