外源性一氧化碳抗大鼠肢體缺血再灌注所致心肌損傷的實驗研究

李婧 楊香敏 宋巧 盧海麗 陳娜 史萬英

再灌注嚴重的缺血肢體后，該肢體的損傷反而會加重，甚至引發其他遠隔器官的損傷，該現象為缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷，心肌是對缺血較為敏感的組織之一。肢體IR過程產生的大量活性氧物質和炎性介質，進而使中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在心大量扣押，這是肢體IR后心肌損傷發生的中心環節。血紅素氧合酶-1(HO-1)是近來發現的一種可被氧化應激和炎性反應所激活、并對機體具有保護作用的熱休克蛋白，其催化產物一氧化碳(CO)具有抗炎性、抗氧化損傷等重要功效。本文主要研究外源性CO對于肢體IR所致缺血肢體的作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗中，22只8個月大SD雄性大鼠(清潔級)，體重220～250 g，由河北省實驗動物中心提供(動物許可證號，冀504085)，隨機分3組，2只為假手術組(S組);10只為IR組;10只為IR吸入CO組(RC組)。

1.2 方法 隔離暴露3組右后肢股動脈根部，采用無創血管夾交緊，并把創口進行縫合，用止血帶綁扎右后肢根部，造成大鼠肢體缺血。實驗4 h后，除去血管夾和橡皮筋，并灌注48 h，以復制大鼠肢體IR模型。手術后4 h開始進行RC組，讓大鼠持續吸入含有CO(500 ppm)的醫用空氣4 h，每間隔12 h后再吸入4 h，連續進行3次，共12 h;IR組和S組均在正常空氣中呼吸。實驗后，逐一檢查各心肌組織學及橫紋改變情況，應用流式細胞儀檢測肌組織中Bax、Bcl-2及凋亡百分比的值;應用全自動生化分析儀檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)和血清乳酸脫氫酶(LDH)表達的變化。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析和q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外源性CO對心肌組織學的影響 S組心肌細胞形態正常。IR組心肌細胞胞體增大，部分肌細胞變性、甚至壞死;肌漿溶解、被破壞，胞核消失，呈空泡狀;閏盤結構不清;胞間有大量的中性粒細胞浸潤，且廣泛出血。RC組肌組織損傷顯著減輕，可見部分肌細胞變性，肌漿含有空泡，呈灶狀溶解，大部分肌細胞腫大程度減輕。見圖1、2。

圖1 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織結構的影響(HE×400)

圖2 外源性CO對大鼠肢體IR致缺血肢體肌組織橫斷面結構的影響(HE×400)

圖3 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織橫紋的影響(橫紋肌染色×400)

2.2 外源性CO對心肌橫紋的影響 S組心肌肌纖維形態正常。IR組肌纖維變性、壞死，心肌橫紋結構不清，紊亂，部分消失。RC組肌形態基本正常，橫紋明顯，僅見局灶性橫紋排列紊亂。見圖3。

2.3 外源性CO對血清LDH、CK-MB的影響 RC組血清LDH值、CK-MB值明顯低于IR組(P＜0.05)。見表1。

2.4 外源性CO對心肌細胞凋亡百分比、Bax及Bcl-2表達的影響 IR組和RC組比較，心肌促凋亡蛋白Bax的FI值、心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的FI值和心肌細胞凋亡百分比差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織中凋亡百分比、Bax、Bcl-2以及血清LDH、CK-MB水平的影響±s

表1 外源性CO對大鼠肢體IR致心肌組織中凋亡百分比、Bax、Bcl-2以及血清LDH、CK-MB水平的影響±s

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 IR組比較，#P ＜0.05

組別 凋亡百分比(%) Bax Bcl-2 LDH(U/L) CK-MB(U/L)S組(n=2)16.8 ±5.9 1.00 ±0.02 1.00 ±0.16 177 ±57 39 ±17 IR 組(n=10) 30.0 ±2.7* 1.06 ±0.04 1.06 ±0.03* 1 189 ±247* 274 ±77*RC 組(n=10) 22.0 ±2.0*# 1.01 ±0.05# 1.12 ±0.05# 876 ±184*# 204±63*#

3 討論

研究表明，動物肢體IR后吸入適量的外源性CO，對肢體IR所導致的腦、肝、腎等器官損傷具有一定防治作用［1］。

IR損傷是全身性病理過程，涉及身體的多個因素。身體器官長時間缺血后，組成細胞呼吸鏈斷裂、能量代謝產生障礙;進行再灌注后，缺血的該器官會產生及釋放氧自由基和致炎物質等很多有害因子［2］。該有害物質作用于血液成分及血管內皮后，PMN、EC被大量刺激而激活。表達炎性因子、細胞黏附分子，引起PMN的貼壁、黏附、積聚、移出及釋放反應，最終引發全身性炎性損傷［3］。聚集于心肌組織的中性粒細胞和釋放的大量毒性物質是肢體IR所致心肌損傷的中心環節。

醫學研究發現，信使分子CO具有抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡等生物效應［4］。機體在受到重創、休克及氧化應激損傷等病理狀態情況下，機體自身會產生更多 CO［5］。Cepinskas等［6］證實，CO 能夠下調粘附分子ICAM-1的表達、抑制PMN的扣押。CO可以阻斷炎性介質的形成過程，抑制白細胞、血小板的集聚和IL-18介導的炎性反應［7］，并能夠抑制超氧化物的產生及溶酶體的釋放。以上研究從不同側面證明，CO是通過多途徑、多位點發揮其信使分子的作用。據此分析，主動調高內源性CO的表達水平，可能是救治IR損傷的一種較為理想辦法。但是，調高內源性CO的表達水平，需要一段較長時間的誘生過程，因此及時給予適量的外源性CO，可能比誘導內源性CO表達更有使用價值。

當動物機體的肌細胞膜結構完整性受到損傷時，LDH、CK可滲透出肌細胞進入血液循環，進而引起機體損傷。本實驗結果表明，吸入適量CO可增加心肌細胞膜的穩定性，進而保護組織。

組織細胞遭受IR損傷時的重要病理改變為細胞異常凋亡。Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2為抑凋亡蛋白。本實驗結果表明，肢體IR后部分心肌細胞啟動了凋亡程序，吸入外源性低濃度CO能有效阻止心肌細胞凋亡。

IR損傷時，血管內皮損傷，PMN移出、釋放，血管滲出，間質水腫，組織細胞能量代謝障礙，細胞腫脹、變性、凋亡及壞死。本結果顯示肢體IR所致心肌損傷時心肌內中性粒細胞浸潤程度明顯加重，給動物吸入低濃度CO可使浸潤程度減輕，提示CO抗肢體IR致心肌損傷的作用與其抑制中性粒細胞浸潤有關。本研究結果表明在對受擠壓傷、斷肢再植術等患者的救治中，使患者適量吸入低濃度CO，可有效減輕心肌的IR損傷。本研究對于其他炎性疾病均極具潛在的臨床應用價值。

1 史中立，凌亦凌，姚玉霞，等.大鼠肢體缺血再灌注后腎內HO-1表達的變化及意義.中國病理生理雜志，2004，20:371-374.

2 Chatterjee PK.Novel pharmacological approaches to the treatment of renal ischemia-reperfusion injury:a comprehensive review.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2007，376:1-43.

3 Chin BY，Jiang G，Wegiel B，et al.Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization by carbon monoxide results in cytoprotective preconditioning.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:5109-5114.

4 Liu SH，Xu XR，Ma K，et al.Protection of carbon monoxide inhalation on lipopolysaccharide-induced multiple organ injury in rats.Chin Med Sci，2007，22:169-176.

5 Harder Y，Amon M，Schramm R，et al.Ischemia-Induced Up-Regulation of Heme Oxygenase-1 Protects from Apoptotic Cell Death and Tissue Necrosis.Surg Res，2008，17:109-113.

6 Cepinskas G，Katada K，Bihari A，et al.Carbon monoxide liberated from carbon monoxide-releasing molecule CORM-2 attenuates inflammation in the liver of septic mice.Am J Phvsiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294:G184-191.

7 Zabalqoitia M，Colston JT，Reddy SV，et al.Carbon monoxide donors or heme oxygenase-1(HO-1)overexpression blocks interleukin-18-mediated NF-kappaB-PTEN-dependent human cardiac endothelial cell death.Free Radic Biol Med，2008，44:284-298.