HPLC法測(cè)定維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量

張武圣

【摘 要】 目的：建立測(cè)定維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相法，色譜柱為Diamonsil C18柱（250nm×4.6mm，5μm），以乙腈∶0.2%磷酸水（30∶70）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)：207nm，流速：1.0ml/min；運(yùn)用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：牛蒡苷線性回歸方程為Y=67716X-264370，在95.4ng～1980ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9995），連翹苷性回歸方程為Y=96437X-716504，在21.18ng～423.6ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9991），牛蒡苷和連翹苷加樣回收率99.66%、99.48%，RSD分別為0.90%和0.94%。3批維C銀翹片牛蒡苷平均含量分別為10.17、10.06、10.21mg/g，連翹苷平均含量1.97、1.84、2.03mg/g。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于對(duì)維C銀翹片的質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 維C銀翹片；牛蒡苷；連翹苷；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）04-0028-02

維C銀翹片是常用的中成藥，由金銀花、連翹、牛蒡子等多味藥物制成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒等功效，常用于外感風(fēng)熱所致的流行性感冒及發(fā)熱、頭痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛等癥。該藥功效明確，且連翹、牛蒡子在復(fù)方中均起到重要作用。研究表明，牛蒡苷為牛蒡子的有效成分，具有改善糖尿病微血管病變[1]、抑制腎小球纖維化[2]和抗癌[3]等作用；連翹苷為連翹的主要成分，具有抗氧化[4]、抑制甲型流感病毒NP基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)[5]和退熱作用[6]等。本文測(cè)定維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量，建立通過(guò)HPLC對(duì)其質(zhì)量控制的方法，為以后維C銀翹片的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀（配Waters2998紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；CPA2P-F 電子分析天平（東方嘉儀電子科技有限公司）；DL-360A 超聲清洗機(jī)（上海之信儀器有限公司）； SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-6雙列六孔數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博珍儀器設(shè)備制造廠）；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海愛(ài)朗儀器有限公司）。

1.2 [JP3]試藥 維C銀翹片（批號(hào)：110503、110602、110901，廣西盈康藥業(yè)）；牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)：110819-201108）、連翹苷（批號(hào)：110821-201112）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；乙腈（色譜純，Grace Company INC）；甲醇（分析純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（250 nm×4.6mm，5μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：207nm，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取牛蒡苷和連翹苷適量，精密稱定，分別加50%甲醇將其制備成濃度為0.2118mg/ml的連翹苷對(duì)照品溶液和0.954mg/ml的牛蒡苷對(duì)照品溶液。制備的對(duì)照品溶液各取1ml置10ml定量瓶中，加50%甲醇定制刻度，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 [JP3]供試品溶液的制備 取本品數(shù)片，去除包衣，碾磨混勻，精密稱取5g置具塞錐形瓶中，加甲醇25ml，稱量質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻過(guò)濾，取續(xù)濾液10ml，加置中性氧化鋁柱（100～120目，2g，內(nèi)徑0.9cm）上，用50%甲醇洗脫，收集洗脫液置25ml定量瓶中，即得。

2.4 [JP3]陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量制備不含牛蒡子和連翹的陰性對(duì)照藥材，按“2.3”方法進(jìn)行處理，得陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液各10μl，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果陰性對(duì)照色譜中，在與對(duì)照品和藥材出峰時(shí)間處沒(méi)有相應(yīng)的色譜峰，表明其他組分對(duì)牛蒡苷和連翹苷無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 按以上色譜條件，分別用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)1、2、4、8、10、20μl，按以上色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程牛蒡苷：Y=67716X-264370，r=0.9995，說(shuō)明牛蒡苷對(duì)照品在95.4ng～1980ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；連翹苷：Y=96437X-716504，r=0.9991，說(shuō)明連翹苷對(duì)照品在21.18ng～423.6ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μl，分別記錄牛蒡苷和連翹苷的峰面積，計(jì)算其精密度的RSD分別為1.61%、1.84%，表明儀器的精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取維C銀翹片樣品5份，按“2.3”項(xiàng)方法將其制備成供試品并按照上述色譜條件測(cè)定牛蒡苷和連翹苷的含量，記錄牛蒡苷和連翹苷的峰面積，計(jì)算RSD值分別為2.01%和2.14%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量（含10.17mg/g牛蒡苷和1.97mg/g連翹苷）的維c銀翹片約0.5g，共9份，精密稱定，分為3組，每組分別精密加入質(zhì)量濃度已知的牛蒡苷對(duì)照品和連翹苷對(duì)照品0.8、1.0、1.2倍，按照以上供試品的制備方法制備供試品以及按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示牛蒡苷和連翹苷的加樣回收率的RSD分別為0.90%和0.94%，見(jiàn)表1、2。

2.10 樣品的含量測(cè)定 取3批維C銀翹片品（110503、110602、110901），每批取6份，按照以上制備方法及色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的考察 實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同系統(tǒng)的流動(dòng)相進(jìn)行了篩選考察，包括乙腈-水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水溶液，結(jié)果表明：把乙腈-0.2%磷酸水作為流動(dòng)相時(shí)效果最佳，色譜峰峰型及分離度均良好，且保留時(shí)間適宜，故選擇乙腈-0.2%磷酸水作為流動(dòng)相。

3.2 提取方法的考察 維C銀翹片為中藥復(fù)方制劑，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)其進(jìn)行了超聲法和回流法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲法與回流法對(duì)二者含量影響不大，但由于超聲法操作簡(jiǎn)便，故選其為提取方法。

3.3 吸收波長(zhǎng)的考察 維C銀翹片中牛蒡苷[6]在208、224、280nm處均有最大吸收，連翹苷[7]在205、288、277nm處有吸收，通過(guò)綜合考察，發(fā)現(xiàn)其二者在207nm處峰形較好，雜質(zhì)干擾少，故選擇波長(zhǎng)為207nm。

3.4 層析柱的選擇 因維C銀翹片中待測(cè)成分的含量較低，故選擇過(guò)層析柱以防止其他成分干擾致使其含量測(cè)定不準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)聚酰胺、大孔吸附樹脂、中性氧化鋁等填充料進(jìn)行選擇，從測(cè)得含量高、雜質(zhì)干擾少的角度，最終選擇中性氧化鋁為填充料的層析柱進(jìn)行試驗(yàn)。

維C銀翹片是中藥制劑，因其良好的療效而受到廣泛的應(yīng)用。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC法對(duì)維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷進(jìn)行含量測(cè)定，從而更科學(xué)合理的對(duì)維C銀翹片中兩種成分進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，且本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的方法靈敏度高，專屬性好，可以為維C銀翹片中牛蒡苷和連翹苷的含量測(cè)定提供方法依據(jù)。

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（收稿日期：2014.11.12）