柴苓護肝顆粒的提取工藝研究

莫國棟 楊 瑾 周再生 宋鳳蘭 曾維國 李嘉良

1.廣東省中山市第二人民醫院藥劑科，廣東中山 528447；2.廣東藥學院醫藥化工學院，廣東中山 528400

據國家衛生和計劃生育委員會不完全統計，我國目前乙型肝炎病毒攜帶者已達1 億多人。 其中，絕大多數乙型肝炎、 丙型肝炎患者會發展成慢性肝病，目前針對此類疾病治療方法不少，中西藥治療兼具。 文獻報道的中成藥，又存在配方參差不齊、藥味眾多、組方龐雜、使用不方便、服藥禁忌及毒副作用不明等不足，故研究高效、使用方便的中藥顆粒制劑是臨床醫療的迫切需要。

柴苓護肝顆粒是由柴胡、豬苓、黨參等八味中藥組成的醫院特色制劑之一。 方中柴胡具有疏肝解郁，使肝氣條達的功效[1]。王占一等[2-3]研究發現，柴胡提取物對肝臟起到一定的疏肝作用。鄭純威等[4]發現，柴胡皂苷能降低病理模型的死亡率，在一定程度上可改善肝功能的相應指標。 黨參的主要藥理作用是補血作用、對胃腸道的調節作用[5]、急性肝損傷保護作用等。諸藥合用[6-10]，具有疏肝利膽、解酒瀉毒的功效，臨床多應用于酒精性肝病，也有報道其對非酒精性脂肪性肝病有很好的治療作用。本研究擬采用傳統老中醫中藥處方與現代顆粒制劑技術結合的方法，研制出高效且使用方便的新藥。 豬苓多糖、黨參多糖等成分具有明顯的保肝作用，因此本文以總多糖含量作為考察指標，對水提工藝進行優選，以確定最佳水提工藝，為日后生產提供數據支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計[UV-1800，島津儀器（蘇州）有限公司]；十萬分之一電子天平（AUW220D，Shimadzu）；旋轉蒸發儀（RE52C，上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（B-220，上海亞榮生化儀器廠）；AS 系列超聲波清洗機（AS20500A，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；AP-01P 真空泵（AP-01P，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；濃縮鍋（06038，湖南衡陽金一帆制藥設備實業有限公司）；數顯式電熱恒溫干燥箱（10-2A，上海滬越實驗儀器有限公司、滬越科學實驗儀器廠）。

1.2 試藥

葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-000911）， 甲醇（廣州市東江化工廠， 批號：2012071102），苯酚（廣州洛辛寶化學試劑有限公司），濃硫酸（廣州市東紅化工廠，批號：2011080919），磷酸（廣州市東紅化工廠，批號：2011110702），活性碳，對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液，氨水甲醇。

柴胡、豬苓、黨參等八味藥材購于廣州致信藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 因素水平的選擇

通過前期查閱文獻，柴苓護肝顆粒的工藝研究選擇煎煮次數、煎煮時間、加水倍數、醇沉濃度為考察因素，以方中總多糖的含量測定結果采用正交試驗優選工藝。 實驗因素水平見表1。

2.3.4 檢測波長的選擇 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各2 mL，按上述顯色方法，在波長300～600 nm范圍內檢測。結果顯示，供試品溶液、對照品溶液的紫外吸收光譜最大吸收波長均為490 nm，故選用490 nm作為最佳檢測波長。

2.3.5 線性關系考察 精密吸取1、2、3、4、6 mL 對照品溶液置于10 mL 容量瓶中， 用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得系列標準溶液。 按上述顯色方法操作，在490 nm 波長處測定吸光度。以吸光度值（A）對葡萄糖濃度（C）作標準曲線，得回歸方程為：A=0.0142C＋0.0044（r=0.9998，n=5），線性范圍為10.01～60.06 μg/mL，表明在此范圍內， 葡萄糖濃度與吸光度線性關系良好。見圖1。

表1 實驗因素水平

圖1 葡萄糖含量測定標準曲線

2.2 正交試驗濃縮液的制備

取柴胡、豬苓、黨參等八味藥材共90 g，按“2.1”項下正交試驗設計進行提取，合并提取液，濾過，濾液濃縮并定容至100 mL，備用。

2.3 總多糖含量測定

以葡萄糖為對照品， 采用苯酚-硫酸顯色法測定提取液中總多糖的含量。

2.3.1 對照品溶液的制備 將105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品，精密稱取0.1001 g，置于100 mL 容量瓶中，蒸餾水將其溶解并稀釋至刻度，搖勻。 精密吸取5 mL置于50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，得0.1001 mg/mL的溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.2”項下濃縮液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，加入0.3%的活性炭，脫色30 min，濾過，精密量取續濾液0.2 mL， 置于10 mL 容量瓶中， 用蒸餾水定容，得0.1396 mg/mL 的供試品溶液。

2.3.3 顯色方法 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各2 mL，至具塞試管中，另量取2 mL 蒸餾水作為空白，各試管加入1.0 mL 的5%苯酚試液，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，置冷水浴中冷卻10 min，即得。

2.3.6 精密度試驗 取同一葡萄糖對照品溶液，按“2.3.3”項下顯色方法操作，于490 nm 處連續測定吸光度6 次，結果RSD 值為0.19%（n=6），表明儀器的精密度良好。 見表2。

表2 供試品溶液的精密度試驗結果

2.3.7 重復性試驗 分別取相同的6 份供試品溶液，按“2.3.3”項下顯色方法操作，進行測定，計算總多糖含量，結果RSD 為1.3%（n=6），表明該方法的重復性良好。 見表3。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取供試品溶液0.5 mL，共9 份， 分別準確加入葡萄糖對照品55.05、100.1、150.15 mg（每個濃度3 份），按“2.3.2”項下供試品溶液的制備和“2.3.3”項下顯色方法操作，測定吸光度，平均回收率為98.95%，RSD 為1.1%（n=9）。 見表4。

表3 供試品溶液的重現性試驗結果

表4 加樣回收率試驗結果

2.3.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.3.3”項下顯色方法操作，室溫放置，分別于0、15、30、45、60、90 min測定吸光度，結果RSD 為1.6%（n=6），表明樣品溶液在90 min 內穩定。 見表5。

表5 供試品溶液的穩定性試驗結果

2.3.10 正交試驗總多糖含量測定 精密吸取供試品溶液1 mL，按照上述顯色方法顯色，測定其總多糖的含量。 見表6。

2.4 正交試驗結果

正交試驗根據“2.1”項下正交試驗設計對柴苓護肝顆粒進行水提工藝，正交試驗結果見表7，方差分析結果見表8。 實驗結果表明，影響提取效率的因素依次為A ＞D ＞C ＞B，最佳工藝條件為A3B3C2D1，煎煮時間對提取效率影響最小，煎煮次數、加水量、醇沉濃度對提取效率沒有顯著性影響。 為了縮短提取周期，節約能源，結合大生產實際，將最終工藝確定為加10 倍量水， 提取3 次， 每次提取2 h， 醇沉濃度為50%。

表6 正交試驗總多糖含量測定

表7 正交試驗結果

表8 方差分析表

2.5 驗證試驗

按處方量稱取3 份藥材適量，按“2.4”項下優選的工藝進行提取，并測定總多糖的含量。結果表明，優選工藝可行、穩定，可用于科研“柴苓護肝顆粒”的提取工藝。 提取工藝驗證試驗結果見表9，總多糖含量平均值為177.5 mg/mL， 說明該提取工藝條件基本穩定，具有重現性。

2.6 成型工藝的篩選

2.6.1 輔料的篩選 單獨的浸膏很難制成質量標準合格的顆粒，為了使顆粒具有相對較小的吸濕性以及相對較好的流動性，特對制粒輔料進行篩選，選擇無水葡萄糖、糖粉、乳糖、糊精、甘露醇5 種輔料作為被選賦形劑，稱取一定量的濃縮浸膏（相對密度約為1.30，50℃）和等量的不同賦形劑，分別進行濕法制粒。 由表10 可知，甘露醇是可溶性顆粒的優良賦形劑，且不含糖，可制備無糖顆粒，但無黏合性，顆粒易松散，而糊精作為賦形劑，有一定的黏合性，但較硬結，乳糖和葡萄糖制備的顆粒性狀較好，同時考慮到人體排解代謝酒精的過程，需消耗大量糖元，葡萄糖能及時有效地補充人體所需糖分、加速酒精的代謝和排毒，故選擇葡萄糖為最優賦形劑。

表9 提取工藝驗證試驗結果

表10 賦形劑的篩選

2.6.2 顆粒的制備 稱取處方量藥材，按最佳提取工藝即加10 倍水，浸泡0.5 h，煎煮3 次，2 h/次，醇沉濃度為50%，藥液濃縮至相對密度約為1.30（50℃）的浸膏，加入4 倍量的葡萄糖粉，制軟材，過12 目篩濕法制粒，60℃干燥2 h，整粒，即得。

3 討論

柴苓護肝顆粒是由柴胡、豬苓、黨參等八味中藥組成，諸藥合用，具有疏肝利膽、解酒瀉毒的功效。 臨床用于各種慢性肝炎，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、慢性病毒性肝炎等。迄今為止，已從柴胡中分離鑒定出多種化合物及有效成分， 其中包括多糖類成分、幾十種皂苷類化合物及幾百種揮發油類化合物等。柴胡水提取物和醇提取物均具有一定的疏肝解郁，使肝氣條達的功效。 對黨參成分研究的報道較多，主要有多糖類、甾醇類、生物堿類、倍半萜內酯類成分等。 多糖類、氨基酸類、維生素類、微量無機元素類、甾體類及非甾體類（除多糖類外）等多種豬苓的化學成分均已報道，其具有利尿、抗癌和抗菌的作用，利水滲濕是其主要功能。據文獻報道，多糖具有明顯的抗氧化、保肝、調節免疫等作用[11-12]，對腫瘤、肝炎、心血管病、糖代謝調節和抗衰老等疾病的預防和治療，發揮重要的作用[13-14]。 柴苓護肝顆粒的制備工藝路線根據臨床用藥經驗和處方藥材有效成分的性質，以總多糖含量為考察指標，采用水提醇沉路線制備。 采用單因素正交試驗，對煎煮次數、煎煮時間、加水量、醇沉濃度等因素進行考察，優選最佳提取工藝，以顆粒中的總多糖含量為指標，最終確定其工藝路線如下：按處方量稱取柴胡、豬苓、黨參等八味藥材，加10 倍量水，煎煮3次，2 h/次，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.18～1.20（50℃）的浸膏，放冷，加乙醇使含醇量為50%，攪勻，靜置24 h，取上清液濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.28～1.30（50℃）的稠膏，加入葡萄糖粉適量，制成顆粒，干燥，分裝，質檢。 通過中試，柴苓護肝顆粒各項指標均達到預定要求，表明所選工藝合理、可行，可為生產提高理論依據和相應的工藝參數。

現代藥理研究表明，柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有保肝、抗炎、抗病毒、解熱、調節免疫、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性作用[15-18]。方中其他藥物如黨參也含皂苷類成分。干膏得率作為劑型選擇的參考指標，是確定顆粒劑藥物日服量、單服量及包裝規格的重要參數[19-22]。 因此，皂苷、干膏得率也可作為考察的指標，為日后建立其質量標準做準備。 但是目前總多糖含量測定數據不理想，所以筆者將總多糖含量的測定作為后期工藝進一步優化的工作重點。

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