響應曲面法優化附子多糖的微波提取工藝

朱盛林 鄭玲利 袁明勇 趙 霞

成都醫學院第一附屬醫院藥劑科，四川成都 610500

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，中藥中“回陽救逆第一品”。 附子中的主要化學成分有生物堿、多糖、苷類、甾醇、無機鹽等。研究表明，中藥多糖具有免疫調節[1]、抗腫瘤、抗感染、抗病毒、抗氧化[2-3]、抗輻射、降血糖、降血脂[4]、保肝等多種藥理作用。 附子多糖無明顯毒性，其低毒性已受到人們的重視[5]。

作為水溶性化合物， 附子多糖是中藥臨床使用中較大量的成分，因此，對其提取方法及含量的研究有重要意義。傳統的附子多糖的提取工藝研究，均采用煎煮方法[6-7]，可能會導致多糖部分水解。而微波輔助法提取多糖，可以縮短實驗和生產時間，同時還可以提高提取率及產品純度，并且節省溶劑。本試驗首次采用微波輔助提取法進行附子多糖的提取[8-9]，運用響應面法[10]確定提取時間，提取溫度和料液比對于附子多糖提取率的影響， 以獲得附子多糖提取最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

調溫電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）、循環式真空水泵（鞏義市予華儀器有限公司）、旋轉蒸發儀（上海申順生物科技有限公司）、離心機（上海安亭科學儀器制造廠）；紫外可見光光度計UV-1100 型（上海美譜達儀器有限公司）等。 附子購于四川江油（批號：20140219）、無水乙醇（批號：20130102）、苯酚（批號：20140221）、濃硫酸（批號：20130817）、三氯甲烷（批號：20131013）、正丁醇（批號：20131025）、蒸餾水，無水葡萄糖 （批號：20140228）、 鄰苯三酚 （批號：20130822）、 稀鹽酸 （批號：20140418）、Tris （批號：20140308）等為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗多糖提取 附子用自來水清洗干凈，用蒸餾水漂洗2 次，烘干至恒重，粉碎過60 目篩，備用。取干燥的附子粉5 g，加入適量80%乙醇回流3 h 脫脂，抽濾，藥渣揮盡乙醇。 脫脂后藥渣浸泡于蒸餾水中30 min，放入微波爐中提取，濃縮提取液為20 mL，加入無水乙醇配置為80%的乙醇溶液，于4℃冰箱內放置12 h后取出，4000 r/min 離心5 min。 棄上清液，依次用無水乙醇、乙醚清洗沉淀，得到粗多糖。

1.2.2 標準曲線的繪制

1.2.2.1 90%苯酚液的配制 準確移取苯酚90 mL，蒸餾水定容至100 mL，即得90%苯酚液。

1.2.2.2 6%苯酚液的配制 將90%苯酚液稀釋至6%，現配現用。

1.2.2.3 繪制曲線 分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 的0.1 mg/mL 的葡萄糖標準液， 置于10 mL 試管中，各加水補足至2 mL，加入6%苯酚1 mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5 mL 放置5 min，置沸水浴中加熱20 min， 迅速冷卻至室溫， 于490 nm 處測吸光度。葡萄糖濃度為橫坐標X（μg/mL），吸光度為縱坐標Y，繪制標準曲線。

1.3 附子多糖含量測定

將提取得到的多糖20 mg 用蒸餾水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液0.2 mL，加蒸餾水1.8 mL，按標準曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按回歸方程計算待測溶液的多糖濃度[11-13]。含量（%）=（CDf/W）×100%（C 為樣品液中葡萄糖的濃度，單位為mg/mL；D 為稀釋因素；f 為換算因子，單位為/mL；W 為樣品質量，單位為mg。 得到f=1.71）。

1.4 單因素試驗

分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取溫度（60、70、80、90℃）及提取時間（5、10、15、20 min、）對附子多糖提取率的影響。

1.5 響應曲面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，選取單因素試驗3 個因素中的各3 個水平。利用Design-Expert 軟件進行響應曲面分析（RSM），進行Box-Behnken 設計。 編碼表如表1 所示。 采用SAS 對試驗數據進行回歸分析[14]。求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯方程，對微波輔助提取附子多糖的影響因素進行篩選，并做出響應面圖，建模及分析。

表1 響應曲面試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線， 由試驗結果得出回歸標準曲線方程：A=5.9508C+0.0002，R=0.9999。 葡萄糖標準品在 （0～0.16）mg/mL 范圍內呈良好線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 時間對附子多糖提取率的影響

料液比為1∶5， 溫度70℃， 設置提取時間分別為5、10、15、20 min， 考察提取時間對多糖提取率的影響，從圖1 中可以看出，附子多糖提取率隨著提取時間的增加而增高，當提取時間增加到20 min 時，多糖的提取率下降，可能是因為時間過久，多糖發生降解。

圖1 提取時間對附子多糖提取率的影響

2.2.2 溫度對附子多糖提取率的影響

提取時間為10 min，料液比為1∶20，溫度分別設置為60、70、80、90℃， 考察溫度對附子多糖提取率的影響，從圖2 中可以看出，在提取時間、料液比一定的前提下，附子多糖提取率隨著溫度的增加而增高。 當溫度超過80℃時，提取率略微降低，因高溫可能對多糖的結構和活性有一定影響。

圖2 溫度對附子多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對附子多糖提取率的影響

溫度為70℃，時間為10 min，設置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，考察料液比對附子多糖提取率的影響，從圖3 中可知隨料液比的加大， 提取率逐漸提高，超過1∶20 時，提取率趨于穩定。

2.3 響應曲面試驗設計結果

根據單因素試驗結果，選取提取時間、提取次數和料液比3 個因素設計響應面試驗，研究3 個因素不同組合對多糖提取率的影響。試驗因素和水平及試驗結果見表2。

圖3 料液比對附子多糖提取率的影響

表2 附子多糖提取響應曲面設計試驗及結果

2.4 響應面分析擬合回歸方程的方差分析

以附子多糖提取率為響應值，利用Design-Expert軟件對所得數據進行回歸分析， 各因素經回歸擬合后， 得到回歸方程：Y=16.72+0.38A-0.31B-0.26C-0.24AB-0.035AC-0.47BC-2.27A2-1.32B2-2.01C2。運用所建立的數學模型結果進行方差分析，回歸方程模型的F 值為27.15，P 值為0.0001，表明模型是非常顯著的。 失擬項不顯著（P=0.8866），說明該模型是合理的，可以進行下一步的分析預測。 由P 值可知，在實驗范圍內3 個因素對提取率影響的大小順序為： 料液比＞提取時間＞溫度。 A、C、BC、A2、和C2對多糖提取率的影響顯著（P ＜0.05）。 A、B、C 的交互作用大小為AC＞BC＞AB，R2=0.9467，則證明該模型可以解釋響應值的變化有94.67%來源于所選變量即提取時間、 提取溫度、料液比，自變量與響應值之間有相互的對應關系，說明該模型擬合程度較好，可以用來分析和預測多糖提取率。 回歸分析結果見表3。

2.5 響應曲面圖形分析

Design-Expert 軟件處理得響應面三維圖形見圖4～6。 根據所得模型可以看出，隨著料液比的增加，提取率逐漸增加， 但料液比在達到一定值后開始下降，而提取時間先降低后升高， 通過分析得到最優工藝參數：提取時間10.45 min，提取溫度78.85 ℃，料液比1∶19.74。 在此條件下附子多糖的提取率為16.79%。

表3 響應面分析擬合回歸方程的方差分析

圖4 提取溫度與料液比對附子多糖提取率的影響

圖5 提取時間與料液比對附子多糖提取率的影響

圖6 提取時間與提取溫度對附子多糖提取率的影響

2.6 最優工藝條件的確定及驗證

通過Design-Expert 確定最佳工藝條件為： 提取時間10.45 min，提取溫度78.85 ℃，料液比1∶19.74。在這樣的工藝條件，總黃酮提取率的理論值為16.79%。根據儀器及實驗條件，選取提取時間為10 min，提取溫度為80℃，料液比1∶20，進行重復驗證試驗，得到附子多糖提取率為16.10%，與理論值相對吻合，證明響應面法得到的提取參數可靠。

3 討論

借助微波技術，通過響應面分析法對附子多糖提取工藝進行優化，建立了附子多糖提取率的二次多項數學模型，模型顯著，擬合情況良好。各因素對附子多糖提取率的影響次序為： 料液比＞提取時間＞溫度；最優工藝參數：提取時間10 min，提取溫度80℃，料液比為1∶20，提取率為16.10%，大大優于傳統的煎煮提取方法，是一種很好的提取附子多糖的工藝條件。 通過響應面優化法可以確定各因素及其交互作用在工藝過程中對響應值的影響，精確表達因素和響應值之間的關系，并為尋找最優工藝條件并降低開發的時間和成本。 此外，微波提取工藝能有效降低工藝條件的復雜性，而且消耗的能源和時間也較少，為附子綜合利用和附子多糖的產業化提供理論指導。 接下來，本研究組將對采用該方法提取得到的附子多糖的結構及活性做進一步的研究，以豐富附子水溶性成分的藥理結果。

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