單細胞聚團擬胚體形成誘導人多能干細胞造血分化的技術優化

徐鑒城 段永娟 孫 儀 楊 洋 胡 曉

中國醫學科學院血液學研究所 血液病醫院實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020

造血干細胞移植是治療許多血液系統疾病的最有效的方法，但由于造血干細胞來源有限，在臨床治療應用中受到了極大的限制[1-3]。利用多能干細胞體外誘導造血分化獲得造血干細胞是解決這一難題的方法之一[4-5]。 胚胎干細胞（ESC）是指從早期未分化的胚胎內細胞團中獲得的一類多能干細胞。在體外培養過程中，具有無限增殖、自我更新和多向分化等特性。在體外能夠分化為除胎盤以外的幾乎全部成體組織細胞類型[6-8]，因而成為研究從多能干細胞獲得包括造血干細胞在內的組織細胞的重要工具[9-10]。

在誘導多能干細胞分化的多種技術之中，利用擬胚體形成（embryoid body，EB）是一類重要的方法[11-12]。與傳統的基質細胞共培養誘導分化相比[13-14]，EB 形成誘導分化具有多種優勢。 包括易于擴大培養規模，可明確培養基成分易于培養的標準化，采用單細胞離心聚團形成的EB[單細胞聚團擬胚體（Spin-EB）]還具有可控細胞數目并進行外源基因導入等操作的優勢，逐漸成為這一方法的技術主導。 在實際應用中，這一技術受多種因素的影響， 包括EB 形成的培養介質，細胞因子組合及EB 形成細胞數量及分化時間等。 因此，本研究旨在比較商業化的AggreWellTM800 培養板及普通V-96 孔培養皿，以及不同的細胞數量對于多能干細胞形成的EB 效率及進一步造血分化效率的影響，優化多能干細胞造血分化條件，為實現規模化標準化獲得優質的造血干祖細胞提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

H1ES 和IPS 細胞系由中科院廣州生命健康研究所潘光錦實驗室惠贈。 mTeSR1 培養基、Dispase 消化液、Accutase 消化液、AggreWellTM800 培養板、H4435、H4436（Stem Cell 公司），StemlineⅡ培養基（Sigma 公司），雙抗（Gibco 公司），ROCK 抑制劑（Y27632）（R&D公司）， 骨形成蛋白-4 （BMP4）、 血管內皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維生長因子（bFGF）（Peprotech 公司），流式抗體鼠抗人CD34-APC、鼠抗人CD71-PE、鼠抗人CD235a-APC （eBiosciences 公司），V-96 孔板和低吸附24 孔板 （康寧公司）。 倒置顯微鏡（Nikon TS100）（日本尼康公司），流式細胞分析所用的儀器為Canto Ⅱ （美 國BD 公 司）， 臺 式 離 心 機（centrifuge5810R）（Eppendorf 公司）。

1.2 AggreWellTM800 中擬胚體的形成

將P60 至81 代用mTeSR1 無基質細胞培養的H1ESC 集落用Accutase 消化液消化為單細胞，計數，按每個AggreWellTM800 培養板孔中加入1×106個細胞，加入EB 形成培養基，EB 形成培養基為加入50 ng/mL的BMP4、VEGF 和Y27632 的StemlineⅡ。按產品使用操作手冊，將AggreWellTM800 培養板低速離心700 r/min，5 min，放入20%CO2，5%O2低氧培養箱中培養。 48 h后將形成的EB 轉移至低吸附24 孔板中進行形態觀察，EB 計數和誘導造血分化。

1.3 V-96 孔板中擬胚體的形成

ESC 的培養及細胞處理同上。 細胞計數后，重懸于EB 形成培養基，分三組在V-96 孔板中加入細胞。第1 組每個孔中加入3000 個細胞， 第2組每個孔中加入6000 個細胞， 第3 組每個孔加入9000 個細胞，低速離心700 r/min，5 min， 放入20%CO2，5%O2低氧培養箱中培養。 48 h 后將形成的EB 轉移至低吸附24孔板中進行形態觀察，EB 計數和誘導造血分化。

1.4 Spin-EB 的造血分化誘導

將兩種培養介質形成的Spin-EB 重懸于造血分化培養基，加入低吸附24 孔板中。造血分化培養基為加入50 ng/mL 的BMP4 和VEGF，20 ng/mL 的bFGF的StemlineⅡ。放入20%CO2，5%O2低氧培養箱中培養。連續培養5 d，并于第3 天補充新鮮造血分化培養基。

1.5 造血分化Spin-EB CD34+檢測

將上述條件形成的Spin-EB 經造血分化培養后收集， 加入胰蛋白酶消化為單細胞。 將適量單個細胞懸浮溶于100 μL PBS 中， 加入鼠抗人單克隆抗體：anti-CD34-APC。室溫避光孵育15 min，2 mL PBS 洗1次，400 μL PBS 重懸細胞，BD CantoⅡ流式細胞儀檢測CD34+細胞的比例，用FlowJo 7.6 軟件分析流式檢測結果。

1.6 集落形成實驗

將造血分化誘導后的EB 消化為單個細胞，計數2×104～5×104個接種于H4435 培養基中，培養14 d，觀察造血集落形態。

1.7 紅系分化實驗

將造血分化誘導后的EB 消化為單個細胞，取3×105個細胞進行紅系誘導分化。 具體培養方法參見文獻[15-17]。

2 結果

2.1 兩種培養方式下形成的Spin-EB 數量與形態比較

將在AggreWellTM800 及V-96 孔板上形成的EB分別收集后計數并在光學顯微鏡下進行形態觀察。AggreWellTM800 培養板每一培養孔中有300 個EB 形成小室，形成的EB 效率＞90%，且形成的EB 大小均勻，形態較為均一（圖1A）。 在V-96 孔板中按照每孔加入3000、6000、9000 個細胞 （V-3000、V-6000、V-9000），EB 大小受加入的細胞數影響， 且大小和形態上不均勻，EB 形成效率分別為63%，31%和89%（圖1B～E）。

圖1 AggreWell Spin-EB 照片及V-96 孔板Spin-EB 形態及形成效率

2.2 Spin-EB 誘導造血分化后CD34+細胞的比例

將上述兩種培養介質中形成的Spin-EB 轉入低吸附24 孔板，并加入誘導造血分化的細胞因子組合，誘導分化培養5 d 后， 光學顯微鏡下觀察分化EB 的形態特征并收集EB 消化為單細胞后流式分析CD34+細胞比例。結果顯示，AggreWellTM800 培養板中形成的Spin-EB 中誘導造血分化后EB 呈分化良好的三維囊狀空泡，CD34+細胞的比例為22.6%（圖2A）；V-96 孔板形成的Spin-EB 中， 除3000 個細胞/孔的EB 中有部分分化良好的三維囊狀空泡形態，6000、9000 細胞/孔的EB 均呈現為分化不良的實心結構。CD34+分析，3000 個細胞/孔為10.8%、6000 個細胞/孔為1.28%、9000 個細胞/孔為1.23%（圖2B～D）。

圖2 Spin-EB 造血分化誘導培養后形態及CD34+細胞比例

2.3 Spin-EB 來源CD34+造血集落形成和紅系分化能力

為證明上述Spin-EB 來源的CD34+細胞具有造血分化能力，將造血分化誘導第5 天的EB 消化為單細胞后分別加入造血集落形成半固體培養基，以及紅細胞分化誘導培養基。 圖3A 所示， 以臍帶血UCBCD34+造血集落作為對照，Spin-EB 來源的CD34+細胞所形成的BFU-E，CFU-G 和CFU-G 三種集落的形態與UCB 形成的此三種集落相似； 紅系誘導分化培養10 d 后收集細胞經流式細胞儀分析發現， 細胞培養中有26%的細胞表達紅細胞標志抗原CD71 和CD235a， 說明Spin-EB 來源的CD34+具有形成造血集落和向紅系分化的能力。 見圖3。

3 討論

圖3 Spin-EB CD34+的造血集落及紅系分化能力

ESC 能夠無限增殖和多向分化的能力多年來一直都是生物醫學研究的重點， 其中ESC 在體外誘導分化為成熟類型細胞更是重中之重。通過誘導其向造血細胞分化，是有效解決臨床治療中造血干細胞短缺的有效方法之一。通過研究其向特定細胞分化的過程可以幫助建立疾病模型， 用于研究疾病的發病機制，可以幫助開發治療方案，也可以研究生物體在發育過程中基因的表達調控等復雜的生理過程[18-20]。EB 的形成是ESC 進行體外誘導分化的關鍵步驟之一， 懸滴法和基質細胞共培養法是形成EB 的常規方法，但這兩種方法都十分不利于進行外源基因轉染等分子生物學方面的操作，難以進行分子水平上的研究。 本研究采用將ESC 消化為單細胞進行EB 培養的方法，此培養方法不僅培養基成分明確，而且能準確地掌握細胞數，同時也方便進行分子生物學方面的操作。

AggreWellTM800 培養板是StemCell 公司生產的可用于單細胞法培養EB 的培養板，本研究中采用的是AggreWellTM800 型，每個培養孔有300 個小孔。在每個孔中加入1×106個ESC 時， 每個小孔中大約有3000個細胞；V-96 孔板是一種普通的可用于酶聯免疫研究的培養板，其與AggreWell 培養板相比具有相似的空間形態，因此在用V-96 孔板進行EB 培養時，從每孔3000 個細胞為起始， 同時設置6000 和9000 個細胞組。 從形態上看AggreWellTM800 培養板中形成的EB，經過在低吸附24 孔板中再培養5 d 后，不僅數量多而且發育更為成熟，經過同樣的培養，V-96 孔板中3000 個細胞形成的EB 在大小上與AggreWellTM800培養板中形成的EB 最為相似，但是沒有形成明顯的囊狀EB，9000 個細胞形成的EB 雖然形成率較高，但是分化效率較低。 流式細胞儀分析結果顯示，AggreWellTM800 培養板形成的EB CD34+細胞的比例達到了22.6%，V-96 孔板中3000 個細胞組形成的EB CD34+細胞的比例是V-96 孔板中形成的EB 中最高的，比例為10.8%。根據流式結果選擇AggreWellTM800培養板中形成的EB 進行造血集落形成和紅系誘導分化實驗，其BFU-E，CFU-G 和CFU-GM 三種集落的形態與對照組UCB 形成的集落形態相似； 經紅系誘導分化， 有26.1%的細胞表達紅細胞標志抗原CD71 和CD235a。 同時，在AggreWellTM800 培養板中用IPS 細胞進行試驗， 經過相同的培養時間，IPS 形成的EB CD34+細胞陽性率為38.2%。

綜上所述，利用商品化的AggreWellTM800 培養板可以較高效率地形成EB 并誘導造血分化， 但是AggreWellTM800 培養板的缺點在于價格比較昂貴， 不利于進行大規模實驗， 相比之下V-96 孔板雖然在EB形成效率和分化上不及AggreWellTM800 培養板組，但是V-96 孔板價格十分便宜， 尤其適合大規模實驗，因此V-96 孔板中形成EB 的體系也十分值得進一步優化。

[1] Hequet O. Hematopoietic stem and progenitor cell harvesting：technical advances and clinical utility[J].J Blood Med，2015，6：55-67.

[2] Mazini L，Matar N，Bouhya S，et al. Umbilical cord blood banking for transplantation in morocco： problems and opportunities [J]. J Stem Cell Regen Med，2015，10（2)：28-37.

[3] Tamari R，Castro-Malaspina H.Transplant for MDS： challenges and emer-ging strategies [J]. Best Pract Res Clin Heamatol，2015，28（1）：43-54.

[4] Liu S，Xu Y，Zhou Z，et al. Progress and challenges in generating function hematopoietic stem/progenitor cells from human pluripotent stem cells[J].Cytotherapy，2015，17（4）：344-358.

[5] Daley GQ. Deriving blood stem cells from pluripotent stem cells for research and therapy [J]. Best Pract Clin Haematol，2014，27（3-4）：293-297.

[6] Thomson JA，Itskovitz-Eldor，Shapiro SS，et al. Embryonic Stem Cell Line Derived from Human Blastocytst [J]. Science，1998，282（5391）：1145-1147.

[7] Ware CB，Nelson AM，Mecham B，et al. Derivation of naive human embryonic stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci，2012，111（12）：4484-4489.

[8] Van Orman JR，Si-Tayeb K，Duncan SA，et al. Induction of cardiomyogenesis in human embryonic stem cells by human embryonic stem cell-derived Definitive endoderm [J].Stem Cells Dev，2012，21（6）：987-994.

[9] Tesarova L， Stejskal S， Koutna I. Driven hematopoietic differentiation of embryonic stem cells：epigenetic perspectives [J]. Curr Pharm Des，2014，20（11）：1674-1686.

[10] Forte L， Berardi AC. Stem cell technologies based on hemangioblast technology focusing on human blood cells [J].Recent Pat Drug Deliv Formul，2013，7（1）：4-8.

[11] Kurosawa H. Methods for inducing embryoid body formation：in vitro differentiation system of embryonic stem cells [J]. J Biosci Bioeng，2007，103（5）：389-398.

[12] Weitzer G. Embryonic stem cell-derived embryoid bodies： an in vitro model of eutherian pregastrulation development and early gastrulation [J]. Handb Exp Pharmacol，2006，（174）：21-51.

[13] 張緒超，陳惠芹，黃紹良，等.含人AGM 區基質細胞培養體系定向誘導胚胎干細胞為造血干細胞的實驗研究[J].中國病理生理雜志，2007，23（9）：1747-1751.

[14] Lee KY，Fonq BS，Tsang KS，et al. Fetal stromal niches enhance human Embryonic stem cell-derived hematopoietic differentiation and glob-in switch[J].Stem Cells Dev，2011，20（1）：31-38.

[15] Hu J，Liu J，Xue F，et al. Isolation and functional characterization of human erythroblasts at distinct stages：implications for understanding of normal and disorder erythropoiesis in vivo [J]. Blood，2013，121（16）：3246-3252.

[16] Grover A，Mancini E，Moore S，et al.Erythropoietin guides multipotent hematopoietic progenitor cells toward an erythroid fate [J]. J Exp Med，2014，211（2）：181-188.

[17] Smith BW，Rozelle SS，Leung A，et al. The aryl hydrocarbon receptor directs hematopoietic progenitor cell expansion and differentiation[J].Blood，2013，122（3）：376-385.

[18] 沈干，汪錚，叢笑倩，等.組織工程中的新型種子細胞——胚胎干細胞[J].國外醫學：生物醫學工程分冊，2001，24（3）：97-101.

[19] Zavazava N. Progress toward establishing embryonic stem or induced pluripotent stem cell-based clinical translation [J]. Curr Opin Organ Transplant，2014，19（6）：598-602.

[20] Vallier L，Pedersen RA.Human embryonic stem cells：an in vitro model to study mechanisms controlling pluripotency in early mammalian development[J].Stem Cell Rev，2005，1（2）：119-130.