全新含氮化合物消毒劑殺菌效果研究

王 琳，周立冬，劉謀元，劉理金，崔 輝，佟 巍，劉愛兵

化學消毒劑的使用歷史悠久，殺菌效果明顯，價格低廉，是臨床消毒工作的重要方法之一，在防病防災等領域已取得廣泛應用[1]；其主要作用是以一定的形式對病原微生物進行殺滅，從而阻斷微生物滋生條件及疾病傳播途徑[2]。目前，國內外常用的化學消毒劑有：含氯化合物、氧化劑類、季銨鹽化合物、酚類化合物、醛類化合物、氧化電位水、醇類、銀和碘化合物類等。這些消毒劑作用于人體或環境、物體表面，起消毒滅菌的效果，但對人體及環境也會產生危害，某些危害嚴重的消毒劑已是目前禁止使用的產品。在災害救援領域，也存在消毒效力不足和過度消殺兩大弊端，故開發新型化學消毒劑以增強消毒效力、減少對人與環境的危害已刻不容緩。全新含氮消毒劑彌補了常規消毒劑的不足，更安全、環保，本實驗將對其殺菌效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 試劑：主要成分為醛類衍生物、季銨鹽、螯合劑、原料A的含氮消毒劑，中和劑，LEAGENE芽孢染色液，芽孢懸液，Ruitaibio營養瓊脂。儀器：上海森信恒溫培養箱DRP-9082、上海森信烤箱DGG-9140(A)、蘇州凈化超凈臺VS-1300L-U、吉爾森單道加樣槍G23、新華蒸汽滅菌器TMQ.C5070J。

1.2 方法

1.2.1 芽孢懸液的制備 第1天：（1）營養瓊脂培養基平板、營養肉湯培養基制備。（2）接種芽孢菌：取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管吸加適量營養肉湯培養基，輕柔吹吸數次，使菌種融化分散。取含5～10 ml營養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養 18～24 h。第2天：用接種環取第1代培養的菌懸液，劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，于37℃培養18～24 h。第3天：挑取上述第2代培養物中典型菌落，接種于營養肉湯培養基，于37℃培養 18～24 h，即為第3代培養物。第4天：用10.0 ml吸管吸取5.0～10.0 ml 第3～5代的18～24 h營養肉湯培養物，接種于羅氏瓶中營養瓊脂培養基平板表面，將其搖動使菌液布滿營養瓊脂培養基的表面，再將多余肉湯培養物吸出，將羅氏瓶置于37℃溫箱內，培養5～7 d。1周后：營養瓊脂培養基平板養物，用10.0 ml 吸管加10.0 ml 無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內吸加5.0 ml 無菌蒸餾水，重復洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5 min，打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。

1.2.2 芽孢染色 （1）常規涂片。（2）滴加石炭酸復紅染色液于涂片上，緩慢加熱使染液冒蒸汽但不沸騰，并繼續滴加熱液不使涂片上的染液蒸干，維持5 min。（3）待涂片自然冷卻至室溫，傾去染液。用脫色液脫色至無紅色染液流出為止，水洗。（4）滴加堿性美藍染色液，復染2～3 min。（5）輕輕水洗。（6）用濾紙沿涂片邊緣吸干水分，鏡檢。成功制備芽孢懸液，石炭酸復紅染色顯示芽孢被染成紅色呈圓形或橢圓形小體，菌體藍色，見圖1。

圖1 芽孢顯色結果

1.2.3 中和劑和培養基的配制 （1）中和劑：0.3%硫代硫酸鈉、0.3%卵磷脂、0.5%吐溫、80的胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptic soy broth，TSB)，取上述成分混合，微溫溶解，調pH值約7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌后為（7.3±0.2），分裝備用。（2）培養基：營養瓊脂（18 g/1000 ml），加熱煮沸，121℃高壓滅菌25 min，培養皿10 ml分裝備用。

1.2.4 消毒實驗 試驗組：（1）菌種準備，枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢；（2）制備濃度在1×105cfu/ml的枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢；（3）配置濃度為1%、2%、3%的含氮化合物消毒劑各12 ml為試驗組1、試驗組2、試驗組3，每組吸取4 ml與制備好的枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢菌懸液1.0 ml混合，迅速混勻并立即計時；（4）當溶液反應至預定時間后（10、20、30 min），分別吸取0.5 ml溶液加入到4.5 ml經滅菌的中和劑中，混勻；（5）涂板，畫線接種細菌。37℃，培養48 h。

對照組：（1）陽性對照用4.0 ml磷酸鹽緩沖液代替4.0 ml消毒劑與1.0 ml菌懸液反應，并取0.5 ml混合液與4.5 ml的中和劑反應，進行平行實驗，作為陽性對照。（2）陰性對照分別取此次實驗相關的溶液（即無菌純化水，磷酸鹽緩沖液，中和劑，培養基）各1.0 ml，分別與4.0 ml磷酸鹽緩沖液混勻，混勻后各取0.5 ml混合液與4.5 ml中和劑混合，進行平行試驗，作為陰性對照。

實驗完成后，所有實驗樣本送至化驗室37℃恒溫箱中培養48 h后計數。平均滅活對數值的計算：設陽性對照組菌落數為No，試驗（消毒）組菌落數為Nx，平均滅活對數值=lg No-lg Nx。

2 結 果

2.1 消毒實驗 試驗組1、試驗組2、試驗組3分別與濃度為105cfu/ml的芽孢懸液作用10、20、30 min三個時間段，37℃培養箱培養48 h時菌落計數，見表1。

表1 瓊脂板芽孢菌落計數結果

2.2 試驗組平均滅活對數值 殺滅對數值就是指當微生物數量以10為底的對數表示時，滅菌前后微生物對數數量的差值[3]。平均滅活對數值 = lg No－lg Nx 計算結果顯示,與對照組比較，3種濃度消毒劑均有殺死芽孢的作用，并且隨著消毒劑濃度的增加，殺菌時間縮短。1%濃度消毒劑隨著作用時間延長，殺菌能力增強；而2%濃度的消毒劑作用30 min，3%濃度的消毒劑作用20 min，對枯草桿菌黑色變種芽孢的清除率均達到100%。見表2。

表2 試驗組不同濃度消毒劑平均滅活對數值計算結果

3 討 論

消毒劑是指用于殺滅傳播媒介上病原微生物，使其達到消毒或滅菌效果且無害化要求的制劑[4]，消毒是預防和控制傳染病流行的重要措施和手段，正確掌握消毒知識，提高對消毒工作的意識和重視程度，規范正確的行為對于預防和降低傳染性疾病的發生具有積極而長遠的意義[5]。國際消毒行業優秀消毒劑應體現在，（1）安全：對人無害（無生物毒性） （LC50、LD50濃度很高）。（2）環保：對生產環境無污染（材質無腐蝕性）；分解產物無有害物質殘留，對生態環境無害。（3）殺毒機理確切：復配技術已成為重要研究方向，復方消毒劑克服了單一消毒劑單獨使用時的缺點，增加了殺菌作用。（4）殺毒效能高：高效，滅菌能力強，作用時間快。近年來，地震、洪澇等自然災害頻發[6]，研發無毒、環保的化學消毒劑在災害救援醫學領域具有重要科學意義和應用價值，同時，在日常醫療體系及民用市場領域也有重要的社會、經濟效益。

本實驗所用含氮消毒劑的主要成分有醛類衍生物、季銨鹽等，其符合湖南省疾控中心殺菌譜-高效廣譜以及衛生部安全、環保標準。季銨鹽屬陽離子表面活性劑，其殺菌機理主要是通過在水中形成帶正電荷的物質，吸附于帶負電荷的微生物表面，形成微團，通過滲透作用進入細胞膜的類脂層，改變膜的滲透性，當季銨鹽濃度足夠高時，胞膜非雙層結構的形成可導致細胞膜的破裂和細胞內容物的滲漏[7]，阻斷細菌或病毒DNA復制，完成滅菌。

影響消毒劑作用效果的因素有很多，其中，消毒劑濃度的影響至關重要[8]。本實驗研究顯示，與對照組比較，3種濃度消毒劑均有殺死芽孢的作用，并且隨著消毒劑濃度的增加，殺菌時間縮短。1%濃度消毒劑隨著作用時間延長，殺菌能力增強；而2%濃度的消毒劑作用30 min，3%濃度的消毒劑作用20 min，對枯草桿菌黑色變種芽孢的清除率均達到100%。

本實驗結果表明，3%濃度消毒劑可以在較短時間內殺死枯草芽孢桿菌，適用于需要快速高效殺毒的場所或情景。地震、泥石流、洪澇等重大災害發生時，不僅嚴重影響廣大人民群眾的生命財產安全，還會導致環境污染、傳染病疫情等次生災害。因此，在災害發生后可使用3%濃度的消毒劑對災害現場進行全面消殺，及時防止疫情的發生，并保障救災工作的順利開展。1%濃度的消毒劑能在30 min內將枯草芽孢桿菌全部殺死，因而可將其廣泛應用于物體浸泡消毒、家庭保潔、園林防病治病等領域。

本實驗中全新含氮消毒劑可對枯草桿菌黑色變種芽孢產生高效清除能力，但其對其他微生物是否同樣具備殺滅效果還有待進一步研究。

[1]肖佳慶，李 俐，高珉之，等. 兩種含氯消毒劑對枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅效果及相關性能的實驗觀察[J]. 醫學動物防制，2015，31（6）: 626-630.

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