苦蕎提取物中槲皮素在糖尿病大鼠體內的藥動學研究

袁銘蘭，田玉芳，孫 晨

苦蕎為蓼科蕎麥屬植物苦蕎麥Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn .的干燥成熟種子[1]。近年來，隨著藥食兩用資源的不斷開發，有關苦蕎的研究逐漸增多。苦蕎富含蘆丁、山萘酚、山萘酚-3-O-蕓香糖苷及槲皮素等黃酮類化合物[1]，現代藥理研究其具有降糖降脂抗氧化等作用[2,3]。槲皮素是苦蕎中主要的黃酮成分之一，關于槲皮素單體的藥動學研究已有報道[4,5]，但有關苦蕎提取物中槲皮素的藥動學及在病理狀態下的藥動學尚未見報道。本實驗對苦蕎提取物中槲皮素在正常大鼠及糖尿病大鼠體內的藥動學進行了研究，以期對含苦蕎的藥品及保健食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 日本島津LC-20AT高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測器，N2000色譜工作站）；高速離心機（美國Sigma公司）；METTLER AE240分析天平（梅特勒儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（江蘇金壇中大儀器廠）。

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406）；苦蕎提取物（自制，HPLC法測得槲皮素含量為31.46 mg/g）；甲醇、乙腈（色譜純，美國天地試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團），其余試劑均為分析純。

雄性SD大鼠[江蘇大學動物實驗中心，合格證號：SCXK（蘇）2009-0002]15只，平均體重（250±20）g。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）按如下梯度洗脫：0～20 min，25%～40% B；20～23 min，40%～50% B；23～35 min，50%～75% B；流速：1 ml/min；檢測波長：370 nm；柱溫30 ℃；進樣20 μl。

1.2.2 苦蕎提取物的制備 稱取干燥的苦蕎粉末50 g，置1 L燒瓶中加入10倍量70%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，濾渣用70%乙醇潤洗，合并濾液，濃縮并干燥即得，經HPLC測得苦蕎提取物中槲皮素含量為31.46 mg/g。

1.2.3 對照品溶液的配制 精密稱取槲皮素對照品適量置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得含槲皮素68.4 mg/L的對照品溶液。

1.2.4 血漿樣品預處理 精密吸取血漿0.1 ml，加0.2 ml乙腈沉淀蛋白，渦流振蕩1 min，13 000 r/min，離心5 min，取上清0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣20 μl。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 方法的專屬性 將空白血漿、空白血漿中加入槲皮素對照品、灌胃苦蕎提取物后正常大鼠血漿樣品及灌胃苦蕎提取物后糖尿病大鼠血漿樣品按“1.2.1”項下進樣，考察槲皮素主峰的特異性，是否與其他峰分離度良好。

1.2.5.2 線性范圍及檢測限 精密吸取槲皮素對照品溶液適量，置于1 ml離心管中，加入大鼠空白血漿100 μl，配制成槲皮素濃度為0.171、0.342、0.684、1.710、3.420、6.840 mg/L的血漿樣本，并進行色譜分析，以峰面積Y對血藥濃度X進行線性回歸。

1.2.5.3 準確度和精密度 配制含槲皮素0.285、0.855、3.420 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品，各濃度測5次，連續測定5 d，計算槲皮素的含量，求算方法的準確度和精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制含槲皮素0.285、0.855、3.420 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品各5份，進樣20 μl，測定得到峰面積（5次測定的平均值）A1；以同時配制等濃度的對照品溶液進樣得到的峰面積（5次測定的平均值）A2作為對照，計算得出低、中、高3個質量濃度的血漿樣品中槲皮素的提取回收率（R=A1/ A2×100%）。

1.2.5.5 穩定性考察 配制含槲皮素的低、中、高3個濃度0.285、0.855、3.420 mg/L的血漿樣品，考察室溫放置穩定性、臨時儲存穩定性及長期儲存穩定性。

1.2.6 藥動學研究 將15只平均體重為（250±20）g的雄性SD大鼠分為2組，其中模型組10只，對照組5只。適應性飼養3 d后，禁食1夜。模型組雄性SD大鼠10只高脂高糖飼料喂養2周后，一次性腹腔注射35 mg/kg STZ（溶于0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，pH 4.5）造糖尿病模型，對照組注射同體積的枸櫞酸緩沖液。48 h后大鼠禁食12 h，測定空腹血糖，取5只血糖高于14 mol/L的模型組大鼠用于實驗研究[6]。將模型組和對照組大鼠同等條件下飼養4周。將飼養4周的模型組和對照組大鼠（于實驗前3 d重新測定血糖）給藥前禁食12 h，自由飲水，兩組大鼠灌胃給藥苦蕎提取物0.5 g/kg（給藥劑量按槲皮素算為15.73 mg/kg），并于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，分離血漿，-20℃保存。

1.3 統計學處理 血藥濃度數據采用3P97軟件進行處理，其余數據采用DAS 2.0統計軟件進行處理，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 方法的專屬性 空白血漿、空白血漿中加入槲皮素對照品、灌胃苦蕎提取物正常大鼠血漿樣品、灌胃苦蕎提取物糖尿病大鼠血漿樣品色譜圖見圖1。從圖中可知，槲皮素與其他干擾組分分離效果良好，無雜質峰干擾。

2.2 線性范圍及檢測限 線性方程為Y =6973.5X +151.64 （r2=0.9995），血漿中槲皮素在0.171～6.840 mg/L之間線性關系良好，血漿中檢測限為0.0570 mg/L。

2.3 準確度和精密度 該方法的準確度和精密度結果如表1所示。

2.4 提取回收率 低、中、高3個濃度血漿樣品中槲皮素的提取回收率分別為83.1%、85.6%、84.8%，平均提取回收率為84.5%，符合藥動學實驗要求。

2.5 穩定性考察 結果表明，血漿樣品預處理后室溫放置24 h穩定；樣品經4℃冰箱儲存72 h保持穩定；樣品在-20℃冰凍保存2周穩定。

圖1 大鼠血漿樣品中槲皮素的HPLC色譜圖

表1 血漿樣品中槲皮素的準確度和精密度 （n=5；±s）

表1 血漿樣品中槲皮素的準確度和精密度 （n=5；±s）

濃度（mg/L） 日內精密度日間精密度測量值（mg/L） 準確度（%） 精密度（%） 測量值（mg/L） 準確度（%） 精密度（%）0.285 0.272±0.006 95.5 2.21 0.268±0.006 94.2 2.24 0.855 0.832±0.015 97.3 1.80 0.819±0.022 95.8 2.69 3.420 3.242±0.044 94.8 1.36 3.263±0.039 95.4 1.20

2.6 模型組大鼠的體重和血糖 與對照組大鼠體重（268.3±17.2）g、血糖（5.28±0.27） mmol/L比較，大鼠造模4周后體重（203.5±12.9） g、血糖數據（21.04±3.18）mmol/L明顯變化，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠呈現明顯的糖尿病癥狀：多飲、多食、多尿及體重急劇減少。血糖數據表明模型組大鼠為典型的糖尿病。

2.7 藥動學結果 血藥濃度數據見表2、3，用3P97藥動學程序對血藥濃度數據擬合計算，結果表明苦蕎提取物中的槲皮素在正常大鼠和糖尿病大鼠體內的藥動學均符合二房室模型，主要的藥動學參數見表4，其平均藥-時曲線見圖2。

3 討 論

表2 5只正常雄性SD大鼠體內槲皮素血藥濃度數據（mg/L）

成功制備糖尿病大鼠模型是本實驗的重要組成部分。目前，糖尿病大鼠造模以化學損傷法為主，即通過注射四氧嘧啶、鏈脲佐菌素、雙硫腙等化學藥物，制備糖尿病大鼠模型。也有一次性腹腔注射STZ55-60 mg/kg造模，還有高脂高糖飼料喂養聯合腹腔注射低劑量STZ造模[6-9]，綜合考慮大鼠造模的成活率以及與人體Ⅱ型糖尿病癥狀的接近，故本實驗組選用高脂高糖飼料喂養聯合鏈脲佐菌素腹腔注射制造糖尿病大鼠模型，劑量為35 mg/kg。

表3 5只雄性糖尿病SD大鼠體內槲皮素血藥濃度數據（mg/L）

糖尿病患者機體代謝旺盛，典型癥狀表現為多飲、多食、多尿、身體消瘦，即“三多一少”。預實驗時曾選用體重為180～220 g 大鼠進行造模，多數大鼠因過度消瘦或死亡，從而未完成實驗，故本研究選擇體重為 250 g左右的大鼠以保證實驗順利進行。

灌胃苦蕎提取物后，槲皮素在糖尿病大鼠體內與正常大鼠體內相比發生了明顯的變化，其中Cmax1、Cmax2、AUC0-12明顯增加。這與文獻[10,11]報道鏈脲佐菌素及高血糖環境能造成肝臟病變以及引起肝臟代謝酶的變化，所以推測可能為體內肝臟損傷及肝代謝酶變化導致槲皮素的代謝降低，從而導致糖尿病大鼠的Cmax和AUC0-12較正常大鼠有所升高。另外文獻[12]中認為可能是糖尿病大鼠腸道微生態紊亂引起的產葡糖醛酸苷酶的細菌增加，從而導致黃酮苷轉化為黃酮苷元。本研究的苦蕎提取物中蘆丁和槲皮素均為其主要成分[13]，由于肝臟病變及肝代謝酶的變化，導致體內黃酮成分蘆丁的升高，繼而蘆丁在體內被葡糖醛酸苷酶代謝去苷轉化為槲皮素，導致了槲皮素在糖尿病大鼠體內Cmax和AUC0-12的升高。本研究表明，同一藥物在不同病理狀態的體內表現為不同的體內過程，這正提示了以后的體內過程研究最好在與人體病癥接近的動物模型體內進行更有實際參考意義。

同時，本研究中大鼠灌胃苦蕎提取物后槲皮素在糖尿病大鼠體內有明顯的雙峰現象出現，表明槲皮素在糖尿病的大鼠腸道中存在重吸收或者同類成分之間的互相轉化。通過上述推測分析，此現象可能為苦蕎提取物中的另一主要黃酮成分蘆丁在糖尿病大鼠體內被葡糖醛酸苷酶代謝去苷轉化為槲皮素，從而導致二次吸收情況的發生，但具體的情況還需通過實驗進一步證實。本實驗研究對于苦蕎提取物的新藥及保健食品的開發，以及以后的臨床使用劑量均有一定的指導意義。

圖2 苦蕎提取物中槲皮素在大鼠體內的藥-時曲線

表3 苦蕎提取物中槲皮素在大鼠體內的主要藥動學參數 （n=5；>±s）

表3 苦蕎提取物中槲皮素在大鼠體內的主要藥動學參數 （n=5；>±s）

藥動學參數 正常大鼠 糖尿病大鼠t1/2β（h） 32.874±11.251 53.381±12.562 AUC0-12（mg·h/L） 5.982±2.361 10.248±4.103 Tmax1（h） 0.25 0.25 Tmax2（h） - 4 Cmax1（mg/L） 1.022±0.280 1.477±0.356 Cmax2（mg/L） - 0.602±0.090

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