組胺H3受體降低電激發收縮的小鼠成肌細胞胞漿中鈣離子濃度*

齊　麟，馮　曉，陳　燕，薛　瑞，張　鳳，王素云，孫素珂，文建國，3

(1鐵道警察學院，河南鄭州450053;鄭州大學第一附屬醫院2河南省高校臨床醫學重點學科開放實驗室，3小兒尿動力學中心和泌尿外科，河南鄭州450052;4河南大學淮河學院，河南開封475001)

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組胺H3受體降低電激發收縮的小鼠成肌細胞胞漿中鈣離子濃度*

齊麟1，2，3，馮曉4，陳燕2，3△，薛瑞2，張鳳2，王素云2，孫素珂2，文建國2，3

(1鐵道警察學院，河南鄭州450053;鄭州大學第一附屬醫院2河南省高校臨床醫學重點學科開放實驗室，3小兒尿動力學中心和泌尿外科，河南鄭州450052;4河南大學淮河學院，河南開封475001)

［摘要］目的:探討組胺H3受體(H3R)在小鼠成肌細胞C2C12成肌分化過程及分化后的橫紋肌細胞中的表達和可能發揮的作用。方法:誘導C2C12細胞成肌分化，測量H3R和分化晚期標志物肌球蛋白重鏈mRNA和蛋白的表達;分化過程中加入H3R拮抗劑ciproxifan，測量分化早期標志物desmin、中期標志物myogenin和肌球蛋白重鏈mRNA的表達。Fluo-4結合劑標記分化后的橫紋肌胞內鈣離子，測量雙極交流電200 mA刺激下，H3R激動劑甲基組胺(RMeHA)對胞漿中鈣離子濃度的影響。結果: H3R和肌球蛋白重鏈在成肌分化過程中表達量逐漸增加。Ciproxifan在成肌分化過程中對3種分化標志物mRNA的表達與對照組相比無差異(P＞0.05)。RMeHA在濃度10 nmol/L～100 μmol/L刺激細胞5～20 min，可呈鐘形降低因交流電引起的肌漿鈣離子濃度的升高(P＜0.05)，其中RMeHA 100 nmol/L在10 min和20 min對電刺激細胞中Ca(2+)的抑制百分率最高。相同濃度的RMeHA 在20 min和10 min時對Ca(2+)的抑制率比其在5 min時高(P＜0.05)。結論: H3R可能在成肌分化過程中的作用不大，而在分化成熟細胞中可以降低電刺激引起的胞漿鈣離子濃度的升高。

［關鍵詞］成肌分化;組胺H3受體;電刺激;鈣離子

［修回日期］2015-02-02

Histamine H3 receptor inhibited electrically evoked cytoplasmic calcium in differentiated skeletal C2C12 myoblasts

QI Lin1，2，3，FENG Xiao4，CHEN Yan2，3，XUE Rui2，ZHANG Feng2，WANG Su-yun2，SUN Su-ke2，WEN Jian-guo2，3
(1Railway Police College，Zhengzhou 450053，China;2Institute of Clinic Medicine，3Peadiatric Urodynamic Center and Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;4Huaihe Hospital of Henan University，Kaifeng 475001，China.E-mail: chenyan.abby@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the expression and possible function of histamine H3 receptor (H3R) in striated myogenesis and the differentiated C2C12 cells.METHODS: H3R and myogenesis late marker myosin heavy chain (MHC) were detected at mRNA and protein levels during C2C12 myogenesis.H3R antagonist ciproxifan was added and the expression of the myogenesis early marker desmin，intermediate markers myogenin and MHC was detected.Differentiated myoblasts were loaded with Fluo-4 calcium indicator dye and the effect of R-(a) -methylhistamine (RMeHA) on the cytoplasmic calcium concentration was determined under the 200 mA electrical stimulation.RESULTS: The expression of H3R and MHC was increased during myogenesis.Ciproxifan incubation had no influence on the 3 striated myogenesis markers (P＞0.05).In C2C12 myoblasts，RMeHA (10 nmol/L～100 μmol/L) effectively diminished cytoplasmic calcium peak when the cells were electrically paced (P＜0.05).The best inhibitory effect of RMeHA was observed at dose of 100 nM for 10 min and 20 min，which was higher than that for 5 min (P＜0.05).CONCLUSION: H3R might have little effect on the myogenic differentiation，but diminishes cytoplasmic calcium peak of the differentiated myoblasts under electrical stimulation.

［KEY WORDS］Myogenesis; Histamine H3 receptor; Electrical stimulation; Calcium ion

人們最早是在大腦中發現組胺H3受體(H3 receptor，H3R)的，它控制組胺的釋放，參與腦內多種神經遞質的調控［1-2］。隨后發現組胺H3R可在周圍神經組織和非神經系統表達，如心、肺、氣管、消化道、子宮、逼尿肌等表達。在心臟交感神經細胞突出前膜中，組胺受體(histamine receptor，HR)的亞型H3R可以抑制鈣離子內流，減低細胞內鈣離子濃度［3］。H3R還可以防止氣道過度收縮［4］。Cardell等［5］報道了低的組胺濃度可以作為一種有效的松弛劑，在平滑肌細胞可能是通過激動H3R發生抑制H1R的效果。隨后在膀胱逼尿肌(平滑肌)細胞中也發現了H3R的表達，并且可能參與了細胞胞漿中鈣離子的活動［6-7］。然而，目前H3R在橫紋肌成肌細胞分化過程和分化后的表達和功能，尚無相關報道。因此我們將首次探討H3R是否參與成肌分化過程，以及在分化后的橫紋肌細胞中是否像在其它細胞中一樣，參與調節胞漿中鈣離子濃度。

材料和方法

1細胞來源與培養

小鼠成肌細胞C2C12 (ATCC)培養在37℃、5% CO2和濕潤空氣的培養箱中。細胞生長液為DMEM培養基內添加10%胎牛血清(HyClone)、10 000 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和左旋谷氨酸;細胞分化液為DMEM液內添加1%胎牛血清、10 000 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和左旋谷氨酸。傳代時用0.5 mmol/L EDTA(含0.5%胰蛋白酶; Gibco)消化貼壁細胞。

2主要材料與試劑

細胞培養液及其配方購于Lonza;各分化標志物引物購于Oligomer; H3R與MHC兔抗人多克隆IgG抗體購于Cell Signaling;無免疫性兔IgG購于R＆D; Alexa Fluor488-偶聯驢抗兔免疫球蛋白購于Life Technologies;驢血漿購于Jackson; 4，6 -二脒-2-苯基吲哚(DABI)顯色試劑盒和Fluo-4鈣離子示蹤劑購于Invitrogen; Ciproxifan和RmeHA購于Sigma。

3實驗方法

3.1 Real-time PCR每孔50 000個C2C12細胞加入12孔培養板中，加入生長液增殖，每24 h換1次生長液。48 h后將生長液換成分化液進行分化，每天換1次分化液。分別測量分化前、分化后2 d、4 d、6 d的細胞中各分化標志物和4種組胺受體亞型mRNA的表達。按操作說明書提取細胞總RNA。RNA純度和濃度的測定均用分光光度計完成，取1.5 μL總RNA溶液，DEPC水作為空白對照，吸光度值為0，分別讀取紫外分光光度儀在260 nm和280 nm波長下的吸光度(A)，計算A260/A280比值。純凈RNA樣本的該比值正常范圍為1.8～2.2。取紫外分光光度儀波長為260 nm下的吸光度值，系統軟件自動計算出RNA濃度(g/L)。抽提450 μg(約2～3 μL)總RNA樣本至無菌的RNase-free的0.5 mL EP管中，加入4 μL 5×iscript Mix，iscript逆轉錄酶，iscript去核酸酶蒸餾水，總反應體積20 μL，置入載有專門cDNA合成軟件的加熱儀器中，25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，最后保持在4℃。取cDNA 2 μL、5×SYBR Mix緩沖液(含dNTPs、Tag酶等) 10 μL、上下游引物(5 μmol/L) 1 μL、雙蒸水7 μL加入PCR合成管中，總反應體積20 μL，4 000 r/min離心2 min混勻后將放入PCR儀中。PCR反應條件: 94℃5 min;94℃30 s，59℃30s，72℃40 s，共35個循環;72℃5 min，冰上驟冷。本實驗采用膽色素原脫氨酶(porphobilinogen deaminase，PBGD)為內參照。Real-time PCR的引物序列見表1。

表1　 Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3.2細胞免疫熒光染色C2C12成肌細胞加入用直徑13 mm圓形蓋玻片覆蓋的24孔培養板中，每孔約20 000個細胞，加入生長液增殖，每24 h換1次生長液。48 h后將生長液變成分化液分化，每天換1次分化液。分別取分化前、分化后2 d、4 d、6 d的細胞進行免疫熒光染色。細胞用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100/PBS破膜，暴露抗原;驢血漿常溫屏蔽非特異抗原，加入I抗工作液(H3R抗體和MHC抗體)或者陰性對照無免疫性兔IgG置于4℃冷藏室內過夜。PBS液清洗細胞后，加入II抗工作液(Alexa Fluor488-偶聯驢抗兔免疫球蛋白)，室溫下孵育1 h;加入DAPI液進行細胞核染色。清洗細胞后，使用vectshield膠將染色標本封閉在載玻片上。Leica DM 6000 B/M顯微鏡濾過波長為488 nm，Leica DFC 420數碼相機獲取圖片，Leica Suite熒光應用軟件分析處理圖片。細胞核染色為天藍色，C2C12細胞胞漿或胞膜出現翠綠色熒光染色為陽性。

3.3H3R拮抗劑對成肌分化標志物的影響C2C12成肌分化過程中，在細胞分化液中每天加入H3R拮抗劑ciproxifan 100 nmol/L。分析ciproxifan刺激組和對照組(未加ciproxifan刺激)中成肌分化早期標志物desmin，中期標志物myogenin和晚期標志物肌球蛋白重鏈在分化6 d后mRNA的表達差異，從而驗證H3R是否在分化過程中發揮作用。

3.4分化成熟的肌肉細胞胞漿中鈣離子濃度的測定將載有分化6 d的C2C12細胞的蓋玻片放入4 μmol/L Fluo-4 AM (Invitrogen)鈣離子示蹤劑Elliot溶液中，室溫下加載示蹤劑30 min，Elliot緩沖液清洗。將細胞轉移到裝載有雙極電極刺激裝置和倒置IX70顯微鏡的37℃恒溫RC-49MFS記錄盒中，調整波長為488 nm，觀測細胞內熒光強度。記錄靜息狀態下細胞胞漿中鈣離子熒光強度，然后用0.5 Hz、10 ms雙極電流200 mA刺激細胞20 s，記錄胞漿中鈣離子濃度峰值。加入不同濃度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L)的H3R激動劑甲基組胺(R-a-methylhistamine，RMe-HA)，分別靜置5 min、10 min和20 min后，雙極電流200 mA刺激細胞20 s，記錄胞漿中鈣離子濃度峰值變化情況。

使用匹配的HCImage軟件ics K.定量分析示蹤劑熒光強度并除去背景干擾，轉換成鈣離子濃度。以自身靜息狀態下胞漿中鈣離子濃度或者細胞本身自然放射性強度作為自身空白對照。電刺激下胞漿中鈣離子濃度峰值作為自身陽性對照。以Elliot溶液代替H3R激動劑RMeHA作為陰性對照。

4統計學處理

實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 13.0統計軟件分析。兩樣本均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1在成肌分化過程中C2C12細胞形態變化和H3R的表達

分化前的C2C12成肌細胞為散在圓形或者橢圓形，貼壁，單核，直徑10 μm。當細胞進入分化階段，細胞之間靠攏接觸，按照同一方向排列融合，在分化6 d后，細胞為多核，長柱型，縱向直徑達到150 μm。

晚期分化標志物MHC mRNA在分化過程中一直處于增長狀態，分化2 d、4 d、6 d后，表達量分別為未分化的肌母細胞的7 168、89 487、279 897倍，各分化階段表達量之間有明顯差異(P＜0.01)。組胺H3R的mRNA在未分化肌母細胞的表達很低，但是隨著成肌分化表達逐漸增高，在分化2 d、4 d、6 d后的表達量是未分化母細胞的26、91、182倍，各分化階段表達量之間有明顯差異(P＜0.01)，見圖1。H3R和MHC蛋白的免疫熒光染色在未分化肌母細胞中與對照組一樣，呈陰性;分化6 d后，染色顯示為強陽性，見圖2。

Figure 1.The morphologic change of the C2C12 cells and quantitative measurements of myosin heavy chain (a late marker) and histamine H3 receptor mRNA expression in C2C12 cells by real-time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖1在成肌分化過程中C2C12細胞形態變化和H3R、MHCmRNA的表達

Figure 2.Immunofluorescence staining of H3R and MHC at 0 and 6 d.圖2 H3R與MHC的免疫熒光染色

2 H3R拮抗劑不影響成肌分化過程中標志物的表達

H3R拮抗劑ciproxifan加入C2C12細胞成肌分化6 d后，早期標志物desmin、中期標志物myogenin 和MHC的mRNA表達與對照組無明顯差異，見圖3。

Figure 3.The effect of ciproxifan on the mRNA expression of myogenesis markers in the 6 d differentiated C2C12 cells.Mean±SD.n=3.圖3 Ciproxifan加入C2C12細胞成肌分化6 d后早中晚期標志物mRNA的表達

3 H3R激動劑RMeHA對收縮的肌肉細胞肌漿中鈣離子峰值的影響

陰性對照組及低濃度RMeHA (1 nmol/L)組中細胞胞漿中鈣離子濃度峰值在電刺激5 min、10 min、20 min均未見明顯差異。當RMeHA濃度為10 nmol/L～100 μmol/L時，刺激5 min、10 min和20 min均能明顯降低胞漿中鈣離子峰值，而濃度為100 nmol/L的RMeHA在10 min和20 min對電刺激細胞中Ca2+的抑制百分率最高。整體看來，同一濃度的RMeHA對Ca2+的抑制效果，在20 min內，隨著時間的增加而稍有增加，即在20 min時所見到的抑制效果比在5 min時有所增加，但差異無統計學意義，見圖4。

Figure 4.The inhibitory effects of R-(a) -methylhistamine (RMeHA) on the cytoplasma calcium concen-tratior under the electrical stimulation.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4甲基組胺對電刺激下的肌細胞胞漿中鈣離子濃度的抑制百分率

討論

我們的研究率先發現了C2C12成肌干細胞分化為橫紋肌的過程中，能夠表達H3R的mRNA及其蛋白質，并且H3R的表達與MHC一致，隨著分化過程呈百倍增加。我們隨后又對H3R做了功能的初步測試，首次探討H3R在成肌分化過程中是否影響分化標志物的表達，以及在分化后的橫紋肌細胞中是否參與調節胞漿中鈣離子濃度。在C2C12成肌分化過程中，我們采用H3R拮抗劑ciproxifan刺激分化中的細胞，發現3種分化標志物的mRNA表達與對照組無差異，從而初步驗證了H3R可能在分化過程中作用不大。因此H3R的作用很可能是在分化后的橫紋肌細胞中發揮功能。由于橫紋肌細胞最突出的特點是由鈣離子啟動的收縮-舒張功能，因此我們測試了H3R對收縮的橫紋肌細胞胞漿中鈣離子的影響。以往的研究報道也證實我們的設想是合理的，如H3R在腦內參與多種神經遞質的調控，被活化后，通過Gi蛋白抑制腺苷酸環化酶，減少環磷酸腺苷(cyclic adenosinemonophosphate，cAMP)的生成，或經Gi蛋白抑制N型Ca2+通道，降低神經細胞Ca2+內流量，從而減少組胺的釋放［8］;在外周器官中，如心臟交感神經細胞突出前膜中，活化的H3R可以降低細胞中cAMP，抑制鈣離子內流，減低細胞內鈣離子濃度，從而抑制去甲腎上腺素的胞吐［3］;在豚鼠十二指腸、回腸和結腸縱肌標本上，RMeHA濃度依賴性抑制電場刺激誘發的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)釋放所致的腸管平滑肌收縮［9］; RMeHA濃度依賴性抑制電場刺激誘發的豚鼠和人離體氣管平滑肌膽堿能性收縮［10］; H3R受體在外周血管有分布，作用是松馳血管平滑肌，降低血管通透性［11］; H3R在膀胱逼尿肌細胞中影響鈣離子的活動［7］。

人體細胞內的游離鈣主要儲存于內質網內，內質網鈣庫作為胞內最大的Ca2+儲存庫，對維持胞內Ca2+動態平衡起關鍵作用［12］。一般認為橫紋肌細胞內質網上的蘭尼受體和三磷酸肌醇受體影響鈣的流動。當細胞膜上的G蛋白偶聯受體激活，可以引起細胞內cAMP改變，導致磷酸化酶的活性升高或者降低，進而使下游的受體或者效應單位(如蘭尼受體)磷酸化或者去磷酸化，進而開放或者關閉肌漿網的鈣離子通道，改變胞漿中的Ca2+濃度。cAMP可以通過cAMP依賴性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)促進平滑肌松弛，降低胞漿內鈣濃度［13］。另有研究證明激活或者抑制三磷酸肌醇受體同樣可以動員或者阻止肌漿網釋放鈣離子，使胞漿中Ca2+增加或者減少［14-15］。H3R早已經被證實為G蛋白偶聯受體，可以通過Gi蛋白抑制腺苷酸環化酶，減少cAMP的生成，因此橫紋肌細胞中H3R被活化后，很有可能降低了細胞cAMP合成，并從而抑制蘭尼受體或者三磷酸肌醇受體，降低內質網中Ca2+流入胞漿中。

在我們的研究中，采用了Fluo-4指示劑動態測量細胞的Ca2+濃度，Elliot緩沖液作為陰性對照，測試時間從加入緩沖液1 min到60 min，每隔5 min作為1個時點，刺激細胞和測量細胞內鈣離子濃度變化，發現大部分細胞在30 min前，指示劑的衰減很少，幾乎所有細胞在加入緩沖液20 min前無衰減。因此我們選用了加入刺激試劑20 min前測試其對細胞中鈣的影響，并且設置了5 min、10 min、20 min 3個時點，大體測試RMeHA發揮作用的最佳時點。結果發現同一濃度的RMeHA對Ca2+的抑制效果，在20 min內，隨著時間的增加而稍有增加，即加入RMeHA 20 min后是RMeHA抑制作用的最佳時點。我們發現最低濃度(1 nmol/L)的H3R激動劑RMe-HA，對收縮細胞胞漿中鈣離子峰值無明顯影響，這主要是由于該濃度過低，可能低于了RMeHA能發揮作用的最低濃度。RMeHA 100 μmol/L對收縮細胞胞漿中鈣離子峰值的抑制作用反而較中等濃度100 nmol/L低，可能由于與H3R功能相反的通路被激活(如H1R或者H2R)，抵消了RMeHA對鈣離子的抑制作用。

總之，我們的研究發現H3R在成肌分化過程中可能對分化作用不大，而在分化成熟細胞中可以降低電刺激引起的胞漿鈣離子濃度的升高，說明其可能減低成熟細胞的收縮作用，維持細胞的抗疲勞或松弛作用。

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通訊作者△Tel: 0371-66295215; E-mail: chenyan.abby@163.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.U1304804)

［收稿日期］2014-11-07

［文章編號］1000-4718(2015)06-1115-06

［中圖分類號］R337.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.026