胸水p16基因純合性缺失的檢測及臨床應用價值

于薇

[摘要] 目的 探討胸水p16基因純合性缺失的檢測及其在臨床上的應用價值。方法 選取該院2010年12月—2014年6月收治的伴有胸水的肺癌患者176例，隨機分為對照組和PCR組各88例，對照組應用胸水脫落細胞學檢測，PCR組應用PCR技術檢測純合性缺失，比較陽性率。 結果對照組88例肺癌所致癌性胸水患者的標本中有52例出現胸水脫落細胞血陽性結果，其陽性率為59.09%；PCR組88例肺癌所致癌性胸水患者的標本中沒有出現一例p16基因第一外顯子純合性缺失，但是有35例p16基因第二外顯子純合性缺失，其陽性率為39.77%。陽性對照組優于PCR組，經統計學處理差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 將p16基因作為肺癌治療的靶基因具有可行性，同時胸水p16基因純合性缺失的檢測方法不僅方便，而且準確率高，可以作為癌癥檢測和預后的重要輔助手段，為廣大的肺癌患者帶來福音，值得臨床推廣。

[關鍵詞] 胸水；p16基因；純合性缺失；檢測；應用價值

[中圖分類號] R [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）12（c）-0034-02

肺癌是治愈率低和致死率高的呼吸系統腫瘤疾病，其發病率和死亡率逐年急劇上升且具有性別差異，對人類生命健康造成嚴重威脅。肺癌的發病原因主要是吸煙、電離輻射、職業與環境接觸、大氣污染、遺傳因素和既往肺部慢性感染。其臨床表現主要包括局部癥狀、全身癥狀、肺外癥狀、侵潤和轉移癥狀，其中局部癥狀有咳嗽、胸痛、胸悶、氣急、咯血和聲音嘶啞，而咳嗽是最常見的局部癥狀，也是肺癌的首發癥狀[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法，40%以上的患者在診斷時病灶已發生轉移，經過傳統的治療方法效果也差強人意，尤其是小細胞肺癌患者5年生存率不足5%[2]。因此，如何對伴有胸水的肺癌患者進行準確檢測，成為了醫學熱點。p16基因又稱為MTS1基因，于1994年被Kamb等發現的一種新的抗癌基因，它是細胞周期中的一種基本基因，其作用是直接參與細胞周期的調控，對細胞增殖和分裂進行負調節[3]。目前，經研究發現有細胞周期剎車裝置之稱的p16基因，在人類腫瘤細胞中出現純合性缺失的現象，同時經臨床研究證實很多癌癥的形成都與p16基因的缺失和突變有關[4]。因此，對p16基因進行純合性缺失的檢測具有重要的臨床意義。將該院2010年12月—2014年6月收治的患者為研究對象，采用胸水p16基因純合性缺失的檢測肺癌收到了較好的效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將該院收治的伴有胸水的肺癌患者176例，隨機分為兩組，其中對照組88例，男61例，女27例，年齡41～75歲，平均年齡58歲；PCR組88例，男62例，女26例；年齡42～74歲，平均年齡58歲。兩組在年齡和性別方面差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 治療方法

1.2.1 對照組 在征得患者同意的情況下，對患者的穿刺部位通過超聲定位后，協助患者采取合適的體位，局部消毒和麻醉后，進行常規的胸腔穿刺。其具體步驟如下：用左手食指和中指將穿刺部位的皮膚固定，右手調整穿刺針的三通活栓裝置，使其與胸腔處于關閉狀態后，在麻醉處將穿刺針緩緩刺入，若針鋒的抵抗感突然消失時，則調整三通活栓使其與胸腔相通，進行抽取胸水，抽取結束方可拔出穿刺針。取出一定量的胸水后，進行胸水脫落細胞學檢測，其檢測步驟如下：離心、制片、干燥、染色，其中染色尤為重要，若染色較深，則背景會影響判斷；若染色較淺，則不易看出細胞的形態。染色后，將固定好的片子放在顯微鏡下觀察，檢測細胞學變化，進行結果統計分析。

1.2.2 PCR組 胸水采集的方法與對照組一致，取患者的一定量（10 mL）的胸水后，離心（3 000轉/min，10 min），沉淀物加生理鹽水混懸后，再加DNA提取液和相關試劑逐步提取和純化DNA模板。在PCR擴增過程中，要加入PCR試劑，其中PCR的五種關鍵要素是p16第一外顯子和第二外顯子引物、dNTP、Taq酶、Mg2+和模板，放入PCR儀中擴增，其PCR條件是預變性94℃、5 min后，變性94℃、30 s，復性55℃、30 s，延伸72℃、30 s，將變性、復性和延伸循環30次后，再延伸70℃、5 min，最后4℃保存產品。配制2%的瓊脂糖凝膠，用水平電泳儀進行電泳40 min后，紫外下掃描照相后，檢測吸光度值，進行結果統計分析。

1.3 統計方法

應用SPSS11.0軟件對數據進行分析，計數資料用率表示，行χ2檢驗。

2 結果

兩組數據比較，陽性率行χ2檢驗，χ2 =6.17，P=0.034，P<0.05，說明經處理差異有統計學意義，見表1。

表1 對照組與PCR組檢測結果對比[n（%）]

3 討論

肺癌是發病率較高的呼吸系統腫瘤疾病，其發病率和死亡率逐年急劇上升，并且該病的發病率和死亡率具有性別差異，其中男性患者的發病率和死亡率位居惡性腫瘤的榜首，女性患者的發病率和死亡率位居惡性腫瘤的第二位[5]，但具有較低治愈率和較高致死率的特點，對人類生命健康造成嚴重威脅。目前，肺癌的發病原因還沒有得到明確闡述，有大量研究資料表明[6]：該病可能與吸煙、環境有重大聯系，其中不吸煙的肺癌患者占吸煙肺癌患者的1/10～1/20，并且年齡越小就開始吸煙越容易患有肺癌，城市居民患有肺癌的幾率比農村的患者高，其主要原因是城市大氣污染要比農村更為嚴重。肺癌的發病原因主要是吸煙、電離輻射、職業與環境接觸、大氣污染、遺傳因素和既往肺部慢性感染，其中吸煙是最嚴重的肺癌高危因素，而職業癌是常見的肺癌疾病。肺癌具有直接擴散、血行轉移和淋巴道轉移三種播散轉移方式，其中淋巴道轉移是最常見的肺癌轉移方式。肺癌的臨床表現主要包括局部癥狀、全身癥狀、肺外癥狀、侵潤和轉移癥狀，其中局部癥狀有咳嗽、胸痛、胸悶、氣急、咯血和聲音嘶啞，而咳嗽是最常見的局部癥狀，也是肺癌的首發癥狀。p16基因又稱為MTS1基因，于1994年被Kamb等發現的一種新的抗癌基因，它是細胞周期中的一種基本基因，其作用是直接參與細胞周期的調控，對細胞增殖和分裂進行負調節[7]。目前，經研究發現人類腫瘤細胞的p16基因有一半會發生純合性缺失和突變，因此被稱為細胞周期的剎車裝置，一旦失靈，則細胞會出現惡性增殖，最終導致惡性腫瘤的發生[8]。近幾年，臨床研究發現，在肺癌、乳腺癌、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腦腫瘤、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤等癌細胞中p16基因出現純合性缺失和突變等現象，證明了p16基因通過缺失和突變的形式，參與了腫瘤的形成。因此在腫瘤患者的易感性和預后方面，對p16基因進行純合性缺失的檢測具有重要的臨床意義[9-11]。由于胸水收集方便，該院將肺癌所致胸膜轉移后的胸水標本作為研究對象，結果表明，PCR組88例肺癌所致癌性胸水患者的標本中沒有出現1例p16基因第一外顯子純合性缺失，但是有35例p16基因第二外顯子純合性缺失，其陽性率為39.77%；對照組88例肺癌所致癌性胸水患者的標本中有52例出現胸水脫落細胞血陽性結果，其陽性率為59.09%。胸水細胞學檢測是一種特異性檢查手段，病理狀態下，在胸水形成的同時，胸膜間皮細胞和惡性腫瘤細胞都會脫落至胸水中，因此可以通過胸水脫落細胞學的檢測來診斷疾病。p16基因的編碼蛋白是細胞周期素D和依賴性激酶的特異性抑制劑，其抑制腫瘤的機制是通過抑制細胞周期進程而抑制細胞增殖[12-13]。絕大多數腫瘤中存在p16 基因的缺失或突變，并且純合性缺失發生的頻率更高，而且主要發生于第二外顯子上，經葉玉坤等研究發現在肺癌組織p16 基因的表達率要遠遠低于癌組織旁邊的正常組織和良性腫瘤的表達率，且表達率的高低與臨床分期密切相關，尤其是在Ⅰ期和Ⅱ期肺癌中，p16 基因的純合性缺失率達到30%以上，并且是非小細胞肺癌[3]。因此，將p16基因作為肺癌治療的靶基因具有可行性，同時胸水p16基因純合性缺失的檢測方法不僅方便，而且準確率高，可以作為癌癥檢測和預后的重要輔助手段，值得臨床推廣。endprint

[參考文獻]

[1] 支修益，陳東紅.非小細胞肺癌外科治療現狀和進展 [J].首都醫科大學學報，2012，30（3）：298-305.

[2] 馬晉平，詹文華，許多榮，等.胃腸道惡性腫瘤P16基因純合性缺失的檢測[J].中華檢驗醫學雜志，2012，23（5）：280-282.

[3] 高越，葉磊光，李娜，等.抑癌基因p16在肺癌中的研究進展[J].現代生物醫學進展，2014，20（43）：3964-3966.

[4] 肖小珍，許娜，張進芳，等.p16基因缺失在兒童與成人急性B淋巴細胞白血病的臨床意義[J].中華血液學雜志，2013， 34（5）：205-206.

[5] 韓志敏.人毛乳頭細胞中P16基因的檢測及意義[J].河北醫科大學，2012，21（6）：106-107.

[6] 張繼華，李曉，張毅，等.P16基因甲基化檢測在肺癌早期診斷中的應用研究[J].中外健康文摘，2013，11（46）：102-103.

[7] 易翔，黃茜，鄭曉婉，等.應用Methylight法檢測胃癌病人p16基因的甲基化狀態[J].臨床檢驗雜志（電子版），2012，2（5）：217-218.

[8] 柯尊富，李淑華，毛曉鵬，等.FISH檢測9號染色體 GLP9 p16基因擴增在膀胱癌臨床診斷中的意義[J].分子診斷與治療雜志，2012， 26（5）：119-120.

[9] 許凱，劉春曉.尿路上皮癌外周血死亡相關蛋白激酶的甲基化與純合性缺失狀態及其意義[J].實用醫學雜志，2012， 28（12）：169.

[10] 李軍，曹愛國.DMBT1基因純合性缺失與乳腺癌病理特征的關系[J].國際檢驗醫學雜志，2014，17 （12）：107-108.

[11] 金燕，王亞南.腺苷脫氨酶 癌胚抗原在胸腔積液鑒別診斷中的價值[J].檢驗醫學與臨床，2012，8（5）：217-218

[12] 吳成利，王詠梅，王革芳，等.胸腔內化療聯合熱療治療惡性胸腔積液臨床研究[J]，實用臨床醫藥雜志，2012，19（5），217-218.

[13] 金燕，王亞南.腺苷脫氨酶癌胚抗原在胸腔積液鑒別診斷中的價值[J].檢驗醫學與臨床，2012，8（21）：106-107.

（收稿日期：2014-11-24）endprint