益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠滑膜ERK1/2的影響

劉家昌 劉淑清 陳湘君 秦熠 汪蔚清

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是由于自身免疫系統病變引起的多系統炎癥性疾病，本病多累及周圍關節。其主要的病理變化在關節滑膜，而關節滑膜的病理變化是在滑膜細胞信號的調控下進行的，因此滑膜細胞信號的轉導異常是本病的重要發病機制之一［1］。

絲裂原活化蛋白激酶(mitagen-activated protein kinase，MAPK)途徑是生物體內廣泛介導細胞內及細胞間的多種生理反應過程的重要信號系統［2］，細胞外信號調節激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK 1/2)途徑是 MAPK途徑的重要組成部分。ERK 1/2可特異性地激活該途徑，其廣泛地存在于關節滑膜組織中，參與滑膜組織的信號轉導過程。近年來的研究表明，ERK1/2途徑的激活，是類風濕關節炎發病的重要機制之一。本實驗通過觀測益氣補腎活血方對佐劑關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠 ERK1/2表達水平的影響，探討該復方對類風濕關節炎的治療機制和作用靶點。

1 材料

1．1 動物

健康 SD大鼠60只，雌性，5周齡，體質量為(160±20)g，SPF級，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，使用許可證:SCXK(滬)2013－0006。實驗動物由上海中醫藥大學附屬普陀區中心醫院實驗動物中心負責飼養。

1．2 藥物

雷公藤多苷片:購自黃石飛云制藥有限公司，生產批號:20070601。益氣補腎活血方:由生黃芪30 g、白芍 30 g、生白術 10 g、巴戟天 20 g、土鱉蟲12 g、骨碎補15 g組成，大鼠中藥用量按體表面積(200 g大鼠=70 kg人類)折算，中藥灌胃制劑由上海中醫藥大學附屬普陀區中心醫院中藥制劑室按既定工藝制作并提供。

1．3 試劑和儀器

RIPA組織裂解液(含有 PMSF，leupeptin，aprotinin等蛋白酶抑制劑)、BCA蛋白定量試劑盒、兔抗大鼠ERK1/2抗體等均購自美國Abcam公司，弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)，購自美國Sigma公司，酶標儀，電泳儀，Image Scanner掃描儀，低溫高速離心機(HERAEUS D-37520德國)。

2 方法

2．1 動物分組

SD大鼠按隨機數字表法分為6組:空白對照組、模型對照組、雷公藤多苷組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組，每組10只。

2．2 造模方法

常規AA大鼠造模方法:采用在造模SD大鼠左后足跖皮內注射弗氏完全佐劑(0．1 mL)的方法誘導AA大鼠模型，于空白對照組大鼠左后足跖皮內注射生理鹽水(0．1 mL)。

2．3 給藥方法

從造模的第14天開始灌胃給藥。空白對照組和模型對照組:將生理鹽水按10 mL/kg予以灌胃給藥，1次/天;益氣補腎活血方治療組:將益氣補腎活血方按常規方法煎煮，并將藥物濃度濃縮為240 mg/mL、480 mg/mL、960 mg/mL 3 種濃度，將低、中、高劑量中藥組大鼠分別按照240 mg/mL、480 mg/mL、960 mg/mL 3種濃度進行灌胃給藥，1次/天。雷公藤治療組:將雷公藤多苷片用滅菌蒸餾水配制成混懸液(1 mL內含雷公藤多苷0．36 mg)，按 3 ．6 mg/kg灌胃給藥，1次/天;各組均給藥40天。

2．4 檢測指標

關節腫脹度。分別在造模后的第1、7、14、21、30、40、50天，以排水法測量大鼠左(右)后足體積。大鼠足體積:各組所有大鼠左(右)后足體積之和/大鼠數量。大鼠滑膜ERK 1/2磷酸化表達。檢測方法:采用免疫印跡法(Western blot，WB)檢測大鼠滑膜ERK 1/2磷酸化表達水平。

2．4．1 滑膜組織蛋白的提取 于造模后的第50天處死大鼠，剝取大鼠關節滑膜組織，于液氮中凍存。將滑膜組織與組織裂解液(RIPA)按1∶8的比例加入離心管并混勻，高速勻漿，每次10秒，停止20秒，重復三次，使組織充分破裂。將裂解液移至離心管中冰上裂解，然后在4℃下離心，取上清液，分裝、保存。

2．4．2 BCA法測定蛋白濃度 BCA工作液，A夜∶B液=50∶1，標準品為BSA牛血清白蛋白，樣品用PBS進行稀釋。將樣品與工作液按1∶8的比例混勻，孵育后，測取OD值。

2．4．3 蛋白濃度調整 以RIPA調整樣品的蛋白濃度為10 mg/mL，煮沸變性。

2．4．4 目的蛋白電泳與WB檢測

將蛋白在120 V分離膠(10%)恒壓，90V濃縮膠(5%)恒壓條件下電泳2小時，在300 mA恒流的NC膜轉膜1小時，轉膜后，麗春紅染色，觀察轉膜效果。洗去麗春紅，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2小時，將膜取出，置于一雜交袋中，加入抗ERK1/2抗體，室溫孵育10分鐘，4℃過夜。第二天在室溫孵育30分鐘，TBST洗膜5分鐘×5次。將膜取出，置于另一雜交袋中，加入酶標二抗，室溫輕搖60分鐘。TBST洗膜5分鐘×6次。ECL顯色，曝光顯像，掃描，保存結果。

2．5 統計方法

采用SPSS 18．0軟件進行統計學分析，各項數據均以均數±標準差±s)表示。計量資料首先進行正態性、方差齊性檢驗。數據方差齊時，用單樣本方差分析(One-way ANOVA)進行組間方差分析;數據方差不齊時用Tambane’s T2法分析;同一組間的重復測量資料比較采用配對t檢驗，P＜0．05為有統計學意義。本文中表1、表2數據符合方差齊性檢驗，組間數據進行單樣本方差分析。

3 結果

3．1 大鼠左后足體積變化

造模第1天，各組大鼠左后足體積間無明顯差異;造模后第7至50天，空白組大鼠左后足體積均小于其它各組，空白組與其它各組比較，差異有統計學意義(P＜0．01);造模第40天，各治療組大鼠左后足體積明顯低于模型組，各治療組大鼠左后足體積和模型組比較，差異有統計學意義(P＜0．01);中劑量中藥治療組與雷公藤多苷組間無顯著差異(P＞0．05);中劑量中藥治療組大鼠左后足體積明顯小于低劑量中藥治療組和高劑量中藥治療組，組間比較，有統計學意義(P＜0．01)。見表1。

3．2 大鼠右后足體積變化

造模后的第1天與第7天，空白對照組大鼠右后足與其它各組比較，均無統計學差異，從造模第14天開始，在不同時間段，空白組大鼠右后足體積均低于其它各組，有統計意義(P＜0．05);其它各組大鼠右后足在造模第14天后，均出現不同程度腫脹，造模后第30天，模型組大鼠右后足體積明顯大于其它組，有統計學差異(P＜0．05);各組治療后前后自身對照，右后足體積均有增加，有統計學意義(P＜0．05)，中劑量中藥組和雷公藤多苷治療組組間比較，右后足體積差別無統計意義(P＜0．05)。見表2。

3．3 大鼠滑膜組織ERK1/2的表達

實驗結果顯示:治療后，組間分析比較，差異有統計學意義(P＜0．05)，益氣補腎活血方組大鼠滑膜組織ERK1/2的表達水平明顯低于模型組，提示益氣補腎活血方能抑制大鼠滑膜ERK1/2的表達;其中中劑量治療組的大鼠滑膜ERK1/2的表達水平明顯低于低劑量組和高劑量組，提示中劑量的益氣補腎活血方是抑制大鼠滑膜ERK1/2的表達最適劑量。益氣補腎活血方能抑制AA大鼠滑膜組織ERK1/2的激活，從而影響ERK1/2轉到通路的活化。見圖1、表3。

表1 各組大鼠左后足體積變化情況(mL，±s)

表1 各組大鼠左后足體積變化情況(mL，±s)

組別 n 劑量(mg/kg)足體積變化1天 7天 14天 21天 30天 40天 50天8 1．64 ±0．09 1．74 ±0．09 1．77 ±0．08模型對照組 10 － － 0．83 ±0．28 1．90 ±0．14 2．05 ±0．10 2．28 ±0．13 2．56 ±0．05 2．66 ±0．08 2．85 ±0．10雷公藤多苷組 10 3．6 0．83 ±0．30 1．88 ±0．11 2．05 ±0．11 2．27 ±0．10 2．52 ±0．08 2．51 ±0．07 2．61 ±0．07低劑量中藥組 10 2400 0．84 ±0．10 1．90 ±0．09 2．06 ±0．12 2．26 ±0．15 2．53 ±0．07 2．56 ±0．10 2．68 ±0．11中劑量中藥組 10 4800 0．83 ±0．02 1．89 ±0．18 2．06 ±0．18 2．25 ±0．09 2．52 ±0．05 2．50 ±0．07 2．60 ±0．05高劑量中藥組 10 9600 0．84 ±0．15 1．89 ±0．22 2．05 ±0．11 2．27 ±0空白對照組 10 － － 0．85±0．08 1．11±0．11 1．33±0．10 1．49±0．0．11 2．54 ±0．04 2．58 ±0．09 2．70 ±0．13

表2 各組大鼠右后足體積變化情況(mL，±s)

表2 各組大鼠右后足體積變化情況(mL，±s)

組別 n 劑量(mg/kg)足體積變化1天 7天 14天 21天 30天 40天 50天7 1．49 ±0．06 1．52 ±0．04 1．58 ±0．08模型對照組 10 － － 0．84 ±0．03 1．10 ±0．11 1．52 ±0．15 1．59 ±0．15 1．69 ±0．09 1．78 ±0．10 1．93 ±0．08雷公藤多苷組 10 3．6 0．83 ±0．03 1．09 ±0．12 1．47 ±0．12 1．61 ±0．09 1．63 ±0．07 1．67 ±0．07 1．81 ±0．07低劑量中藥組 10 2400 0．84 ±0．05 1．10 ±0．09 1．49 ±0．12 1．58 ±0．15 1．64 ±0．07 1．71 ±0．10 1．83 ±0．10中劑量中藥組 10 4800 0．83 ±0．02 1．09 ±0．11 1．50 ±0．11 1．58 ±0．08 1．59 ±0．06 1．66 ±0．07 1．79 ±0．09高劑量中藥組 10 9600 0．82 ±0．05 1．09 ±0．12 1．51 ±0．11 1．59 ±0空白對照組 10 － － 0．84±0．06 0．99±0．05 1．34±0．09 1．43±0．0．11 1．65 ±0．04 1．72 ±0．09 1．84 ±0．13

圖1 各組大鼠滑膜組織ERK1/2的表達

表3 各組大鼠各組大鼠滑膜組織ERK1/2的表達水平比較

分析圖1和表3，各組大鼠滑膜組織中ERK1/2表達程度由低到高的排列順序為:空白組、中藥中劑量組、雷公藤組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、模型組。

4 討論

類風濕關節炎是以慢性滑膜炎和關節結構破壞為主要癥狀的自身免疫系統病，其主要的病理變化發生在關節滑膜。關節滑膜的一個重要組成部分——成纖維樣滑膜細胞，可以分泌基質金屬蛋白酶、化學趨化因子、促炎性細胞因子等，這些物質均可作用于滑膜細胞的信號轉導途徑，引起滑膜細胞的信號轉導異常，最終導致關節滑膜的病理變化［3］。因此滑膜細胞信號的轉導異常是本病的重要發病機制之一。

MAPK途徑是生物體內廣泛介導細胞內及細胞間的多種生理反應過程的重要信號系統。目前在哺乳動物體內已經證實的MAPK信號轉導通路有4條，分別是C-Jun氨基末端激酶(c-jun n-terminal kinase，JNK)通路、P38絲裂原活化蛋白激酶通路、ERK1/2 通 路、ERK5 通 路［4］。ERK1/2 途 徑 是MAPK途徑的重要組成部分。ERK1/2可特異性地激活該途徑，其廣泛地存在于關節滑膜組織中，參與滑膜組織的信號轉導過程。近年來的研究表明，ERK1/2途徑的激活，是類風濕關節炎發病的重要機制之一。

ERK1/2信號通路是細胞內重要的促增殖和抗凋亡通路，可影響下游細胞的周期調節蛋白、凋亡蛋白等分子的活性，在細胞的生長、發育、凋亡過程中起重要作用。ERK1/2信號通路的主要激活途徑有2條:G蛋白偶聯受體途徑和受體酪氨酸激酶Ras途徑。ERK途徑的經典通路為RPTK-Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2。ERK1/2信號通路激活后，可磷酸化膜蛋白、胞質蛋白、轉錄因子等多種靶蛋白［5］。滑膜組織細胞內的白細胞介素(interleukin，IL)1、腫瘤壞死因子α等細胞因子受體，可與配體特異性結合，活化Ras蛋白，激活 ERK1/2信號通路［6-7］。高水平的細胞因子的產生，可能是滑膜細胞增生的重要原因。實驗結果顯示，治療后，各治療組大鼠滑膜ERK1/2的表達水平均明顯低于模型組，提示AA大鼠關節炎癥癥狀的嚴重程度與ERK1/2的表達水平密切相關，ERK1/2信號通路在RA的發病過程中發揮重要作用。

前期研究表明益氣補腎活血方對RA的治療具有良好的療效。益氣補腎活血方能顯著降低關節炎大鼠血清腫瘤壞死因子α和白細胞介素1的水平［8］。益氣補腎活血方通過抑制 RANKL(與骨破壞密切相關的細胞因子)的水平，提高骨保護素OPG的水平，達到了明顯的骨保護作用［9］。益氣補腎活血方促進大鼠T細胞的活化、增殖，并能上調IL-10，下調 IL-17，從而增強了細胞因子的抗炎效應，抑制了細胞因子的促炎效應，具有雙向免疫調節作用［10］。實驗結果顯示，治療后，益氣補腎活血方組大鼠滑膜ERK1/2的表達水平明顯低于模型組，提示益氣補腎活血方能下調關節炎大鼠滑膜ERK1/2的表達水平，抑制關節炎大鼠滑膜組織ERK1/2的激活，從而抑制ERK1/2轉導通路的活化，起到抑制滑膜異常增殖和關節骨質侵蝕的作用。這可能是該方治療類風濕關節炎的作用機制之一。通過對本研究中益氣補腎活血方治療類風濕關節炎療效的觀察，中醫藥對類風濕關節炎滑膜細胞轉導通路的影響會是未來中醫藥治療類風濕關節炎研究的一大熱點。

本研究的不足之處:如果在實驗的不同時間(造模后的14天、21天、30天、40天)，各處死大鼠2只，測量各組大鼠滑膜組織ERK1/2的表達，進行各組大鼠前后不同時間ERK1/2表達水平的比較，更能體現藥物對大鼠體內ERK1/2表達的影響。

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［9］ 劉淑清，陳湘君．益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠OPG和RANKL的影響［J］．中華中醫藥學刊，2012，9(30):2091-2093．

［10］ 劉淑清，陳湘君．益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠IL-10和 IL-17 的影響［J］．風濕病與關節炎，2013，2(12):26-29．