牡丹皮對內毒素性急性肺損傷大鼠的保護作用

湯明杰 葉永山 張旗 蘇浬 趙躍東 曹春琪 雷海民 李強

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接或間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，出現彌漫性肺泡毛細血管膜損傷所致肺水腫和肺不張、微血栓形成、微循環障礙等病理特征［1-2］。ALI發病急、進展快、病死率極高，是臨床上的急危重癥，目前尚無療效較好的藥物治療。目前研究表明肺內過度的炎癥反應是ALI發病的重要機制。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀功效，現代藥理研究表明牡丹皮具有鎮痛抗炎、改善血流動力學和微循環系統等作用［3］，且對肺損傷有一定的保護作用［4］。因此本文從炎性細胞、促炎因子及蛋白的釋放來探討牡丹皮對ALI的干預作用，并期為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物清潔級wistar雄性大鼠60只，體質量200～220g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號:11400700019196。

1.1.2 試劑及主要儀器 牡丹皮(安國藥材市場，批號:20130918)，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為毛茛科芍藥屬植物牡丹的干燥根皮;大腸桿菌內毒素(L2880，sigma);牛血清白蛋白(A7030，PH-7，sigma);醋酸地塞米松片(H12020363，天津柏海藥業);TNF-α、IL-6試劑盒(上海藍基生物科技有限公司);吉姆薩染液(北京博奧拓達科技有限公司);考馬斯亮藍G-250(北京拜爾迪生物科技有限公司)。TXD3型離心甩片機(湖南湘儀實驗室一起開發有限公司);MK3型酶標儀(賽默飛儀器有限公司);Effendorf 5810R離心機(德國);BX40F4型光學顯微鏡(OLYMPUS，日本);AxioCam ERC5s成像系統(德國蔡司數碼成像系統)。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹皮水提物制備 牡丹皮藥材，10倍量水回流提取兩次，每次2小時，過濾，濾液合并，減壓濃縮即得牡丹皮水提物﹙1 mL≈0.35 g﹚。

1.2.2 ALI模型制備 將大鼠隨機均分為5組:生理鹽水對照組、模型組、陽性藥(地塞米松)組、治療組及預防組。各組分別用水合氯醛腹腔注射麻醉，除對照組以外各組分別氣管內滴注內毒素(lipopolysaccharide，LPS)(8 mg/kg)，復制ALI模型。對照組在同樣的條件下，向氣管內注入等體積的生理鹽水。

1.2.3 給藥方法 預防組，在造模前3天灌胃給予牡丹皮水提物，每天一次，每次10 mL/kg。其它各組均在造模2小時后灌胃給藥，治療組給予10 mL/kg的牡丹皮水提物、地塞米松組給予地塞米松片2 mg/kg，對照組和模型組灌胃給予治療組等量的生理鹽水，各組給藥5次，每次間隔約2小時。5組動物均在造模12小時后取材。

1.3 檢測指標

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中多形核白細胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)百分比各組動物隨機取8只，以腹主動脈取血處死后，行氣管插管。用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)進行整肺灌洗，收集BALF，4℃，1300 rmp(離心10 分鐘)，收集上清液，－80℃保存，待測蛋白及細胞因子含量。沉淀細胞用PBS稀釋混勻，進行細胞甩片(離心甩片機，1200 rmp，3分鐘)做細胞涂片，姬姆薩(Gemsa)染色，顯微鏡下分類計數。

1.3.2 BALF中蛋白測定采用考馬斯亮藍法測BALF中蛋白濃度。

1.3.3 BALF中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)檢測用酶聯免疫法測定TNF-α、IL-6的含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 肺組織病理形態學觀察各組余下的3只大鼠處死后，取左肺葉，10%中性福爾馬林固定48小時，常規石蠟包埋，切片，蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)，光鏡下觀察肺形態學變化。

1.4 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差±s)表示，采用單因素方差分析檢驗，各組間兩兩比較采用LSD方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠BALF中PMN百分比和蛋白濃度變化

模型組PMN百分比及蛋白含量均較對照組顯著增加(P＜0.01);地塞米松組、治療組、預防組的PMN百分比及蛋白含量較模型組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);預防組的指標值稍低于治療組，但二者無顯著差異，結果見表1。表明LPS可誘導大鼠肺部PMN大量活化、聚集，促進炎癥的發生、發展;大鼠 BALF中蛋白含量急劇增多，說明LPS刺激后大鼠肺泡通透性增加，肺損傷較嚴重，這些指標均符合ALI的病理特征。另附細胞分類計數Gemsa染色涂片結果圖，見圖1。

2.2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6的濃度變化

模型組BALF中TNF-α、IL-6濃度均明顯高于對照組(P＜0.01);地塞米松組、治療組的TNF-α、IL-6濃度均較模型組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);預防組的TNF-α濃度低于模型組(P＜0.01)，IL-6的濃度與模型組無差異，結果見表2。說明模型組大鼠的前炎性細胞因子含量顯著增加，符合ALI早期的炎癥反應，進一步表明用 LPS誘導 ALI模型較成功。

表1 各組大鼠BALF中PMN百分比和總蛋白濃度( ± s，n=9)

表1 各組大鼠BALF中PMN百分比和總蛋白濃度( ± s，n=9)

注:與模型組比較，a P＜0.05，b P＜0.01。

組別 BALF中PMN百分比﹙%﹚BALF中蛋白濃度(μg/mL)對照組 8.96±2.16b 83.76±30.04b模型組 87.20±1.22 379.08±47.91地塞米松組 44.25±17.32b 251.05±53.66b治療組 65.76±1.64a 143.94±24.79b預防組 42.30±3.77b 105.44±31.39b

表2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6的濃度(± s，n=9)

表2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6的濃度(± s，n=9)

注:與模型組比較，a P＜0.05、b P＜0.01。

組別 TNF-α﹙pg/mL﹚ IL-6﹙pg/mL﹚對照組 10.44±1.09b 130.99±20.68b模型組 26.92±9.50 210.00±57.22陽性藥組 12.52±2.27a 150.44±18.11b治療組 10.97±2.99b 135.52 ±30.36b預防組 10.56±2.19b 205.60±15.15a

2.3 肺組織病理形態學變化

圖1 大鼠BALF中PMN涂片觀察結果﹙Gemsa染色﹚

光鏡下見NS組:肺泡結構完整，大小均勻，肺泡腔清晰、壁薄，肺泡隔微血管、肺泡腔及間質隙內少量充血，未見肺水腫和炎性細胞浸潤。模型組:肺泡結構破壞，肺泡腔變窄，肺泡間隔明顯增厚，肺間質及肺泡充血、水腫、炎性細胞浸潤，肺泡腔內有大量的紅細胞及滲出物。與模型組比較，牡丹皮干預組和地塞米松組大鼠肺組織病變明顯改善:肺組織病變局限且程度減輕，肺泡腔擴張，肺泡間隔增厚不明顯，局部肺間質及肺泡充血、水腫、炎性細胞浸潤，肺泡腔內紅細胞及滲出物明顯減少，另外陽性藥組大鼠肺泡腔擴張更顯著。結果見圖2。

圖2 大鼠肺組織病理學檢查結果﹙HE染色，×100)

3 討論

目前研究表明，肺內或全身過度活化的、失控性炎癥反應是導致ALI/ARDS的主要原因。炎性細胞主要包括肺部中性粒細胞(又稱多形核白細胞，polymorphonuclear，PMN)、肺單核巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)和肺血管內皮細胞(pulmonary vascular endothelial cell，PVEC)等。機體受刺激后產生的大量前炎癥介質(TNF-α、IL-1、IL-6等)及脂質代謝產物，促使炎癥細胞(尤其是多形核白細胞及巨噬細胞)在肺組織的聚集、活化，構成了ALI炎性反應和免疫調節的“細胞網絡”和“細胞因子網絡”，繼而形成炎癥的“瀑布樣”鏈鎖反應，致使肺血管內皮和上皮細胞受到破壞，影響細胞間隙、鈉水轉運系統以及肺表面活性物質的產生，進而大量富含蛋白的液體進入肺組織，形成急性肺水腫，導致透明膜的形成以及肺泡的陷閉［5-6］。

LPS誘導ALI發生時的典型急性炎癥反應，從中醫溫病角度看是“溫邪犯肺”致熱毒壅肺、血熱郁滯的表現，熱毒灼傷氣津、煎熬血液，則見肺毛細血管瘀血、肺間質瘀血、液體細胞滲出、水腫、肺泡透明膜形成等［7-8］，治療時應用清熱解毒、涼血散瘀、活血利水法［9］。牡丹皮作為傳統的清熱涼血藥且具活血化瘀功效，常用來治療熱毒血癥，故本研究從溫病“熱毒血癥”切入，探討牡丹皮對ALI的治療作用。結果顯示:ALI模型大鼠BALF中的PMN、蛋白濃度、TNF-α及IL-6水平在12小時急劇升高，說明ALI發生時肺內產生過度、活化的炎癥反應，造成肺損傷。牡丹皮治療及預防組大鼠BALF中的PMN數、蛋白濃度、TNF-α及IL-6水平顯著降低，肺病變程度明顯減輕，且與陽性藥地塞米松組無顯著性差異。說明牡丹皮通過抑制LPS誘導的中性粒細胞在肺內的聚集、活化，減少肺血管內皮細胞的損害，進而有效的抑制ALI時的炎癥反應，減輕肺部損傷，對肺組織起到很好的保護作用。牡丹皮預防組大鼠的檢測指標值稍低于治療組，可能與牡丹皮提高免疫力、促進抗炎作用有關。本實驗進一步說明清熱涼血藥牡丹皮可以有效地防治急性肺損傷，其機理可能與抑制中性粒細胞的過度活化，下調促炎因子的釋放，減輕炎癥的級聯反應有關。

志謝 感謝北京中醫藥大學基礎醫學院李健副教授為本課題提供實驗平臺。

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