豬繁殖與呼吸綜合征實驗室檢測方法研究進展

于自民 鮑玉芳 何召慶/中國動物保健品有限公司

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豬繁殖與呼吸綜合征實驗室檢測方法研究進展

于自民 鮑玉芳 何召慶/中國動物保健品有限公司

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱“藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，主要侵害不同日齡、品種豬的呼吸和生殖系統，在發病過程中表現為仔豬斷奶前高死亡率、育成豬呼吸困難、母豬繁殖障礙為特征的高度接觸性病毒傳染病，近年來已成為嚴重危害全球養殖業最嚴重的疾病之一。PRRSV感染引起的病毒血癥、持續感染等，對我國養豬業疫病防控構成威脅并造成慘重的經濟損失，目前是影響我國養豬業最重要疫病之一。本文擬對該病的實驗室檢測方法進行歸納總結，以利于快速準確地診斷該病。

一、PRRS概述

PRRS是豬“高熱綜合征”的主要疫病之一，屬于免疫抑制性疾病，常常引起繼發感染，造成免疫失敗等。因此國際獸疫局將其列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病。20世紀80年代末美國南部首次報道了PRRSV，隨后在德國、加拿大、荷蘭一些國家廣泛傳播。由于起初不清楚何種病原體引起，根據臨床上斷奶仔豬呼吸困難、嚴重肺炎、生產性能下降、母豬嚴重的繁殖障礙等，稱之為“豬流行性和呼吸道綜合征”、“豬藍耳病”、“豬神秘病”等。1991年荷蘭學者Wensvoort等用豬肺泡巨噬細胞（PAM）首次分離病毒（LV株），1992年美國學者分離到VR-2332株病毒。1995年我國北京地區暴發PRRS，隨后類似PRRS疾病蔓延到華東、華北等地區，1996年經哈爾濱獸醫研究所鑒定為PRRSV感染。2006年夏以來我國又暴發了以變異美洲型病毒（JX-A1為代表的Nsp2缺失）為病原的高致病性藍耳病，據初步統計，豬感染PRRSV的發病率達50% 以上，死亡率20%～100%。分子流行病學調查數據顯示，2006-2008年高致病性PRRSV毒株占國內流行株的78%，2009年占86%，2010-2011年占88.9%，加重了許多地區養豬業的經濟負擔。

二、PRRSV病原學特性及主要結構蛋白

PRRSV屬于動脈炎病毒科有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因全長約15Kb，包含9個彼此重疊的開放閱讀框（ORF）。PRRSV根據基因遺傳變異分為北美洲型（VR-2332）和歐洲型（LeLystad）兩種基因型毒株。盡管LV和VR-2332毒株幾乎同時出現，且病理癥狀相似，但它們的遺傳特性和抗原之間差異很大，歐洲型LV株和北美型VR-2332株的PRRSV基因組序列的差異達40%左右。PRRSV不同毒株間的致病力和毒力有明顯的差異，目前我國主要流行的是美洲型PRRSV分離株，并在不斷的變異。PRRSV的主要病毒粒子成分是蛋白質，其中GP5、M、N蛋白是主要的結構蛋白，GP5蛋白是由ORF5編碼的糖基化囊膜蛋白，又稱E蛋白，具有受體識別作用，是PRRSV所有結構蛋白中產生中和抗體最強的結構蛋白；M蛋白為膜基質蛋白，遺傳方面最為保守，在病毒感染的早期有很重要的作用；N蛋白由ORF7編碼，為核衣殼蛋白，在感染細胞中的表達水平較高且抗原性較好，一般作為診斷分析的理想靶位。對感染的PRRSV通過對E、M、N三種主要結構蛋白的抗體檢測表明，檢測到的抗體出現順序依次為N、M、E蛋白抗體。

三、PRRS實驗室常用診斷方法

PRRSV沒有特異性的病理變化，易和其他疫病混合感染，很難確診。所以PRRSV疑似病例必須通過臨床癥狀、病例剖檢初步診斷并結合實驗室檢測進行確診。目前實驗室常用的檢測方法有：病毒分離（VI）、反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、熒光定量PCR、血清中和實驗（SN） 、免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）、間接免疫熒光抗體試驗（IFA）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。

1.病毒分離。目前VI是診斷PRRSV最準確、最經典的方法。PRRSV的分布在豬體內隨著PRRSV感染豬的階段（急性感染期、康復期、持續感染期）而變化，一般在急性感染期，多采集血、肺樣品較好，而在持續感染期采集口鼻棉拭及肺樣品較好。病毒分離成功的關鍵是選取病毒含量最高的臨床樣品，盡量新鮮病樣及時送檢。PRRSV病毒分離常用豬原代肺泡巨噬細胞（PAM)，其中大多數歐洲毒株均可適應于PMA細胞。初次分離時，高致病性PRRSV一代便可適應Marc-145細胞并出現細胞聚集、固縮和脫落等典型病變，且分離成功率較高，而經典毒株PRRSV，一般需要先適應PAM細胞后，才能適應Marc-145細胞，且不易出現病變。對于在敏感細胞上不產生病變的細胞還需要結合實驗室其他診斷方法（ELISA、RT-PCR、IFA）進一步鑒定。用病毒分離培養方法檢測PRRSV耗時時間較長、操作繁瑣等缺點，不適用于大規模的檢測。VI是中華人民共和國國家標準規定的PRRS的診斷方法，多用于急性病例的確診。

2.反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術。分子生物學技術主要包括RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR等技術。聚合酶鏈式反應（PCR）是實驗室檢測PRRSV RNA的一種敏感技術，該法不用細胞分離培養病毒，避免了交叉污染的風險，檢測所需的時間也大大縮短，并且具有較高的敏感性和特異性，是臨床上廣泛應用診斷PRRSV的方法。RT-PCR檢測方法的原理是針對PRRSV的 ORF7、ORF6和ORF1b的基因序列設計引物。1997 年S.A.Gilbert等依據ORF1b的保守序列設計引物，建立了同時鑒定美洲型和歐洲型PRRSV的多重RT-PCR和套式多重RT-PCR。2005年Kleiboeker等依據ORF7和 3’末端非編碼區的保守序列設計引物及探針，建立了鑒別、定量、多重檢測美洲型和歐洲型PRRSV的實時熒光定量RT-PCR法。我國農業部動物檢疫所依據ORF7、ORF6保守序列設計引物建立檢測PRRSV美洲型的套式RT -PCR檢測試劑盒。2008年Xiao等參照GeneBank PRRSV的Nsp2基因，利用HPPRRSV在NSP2基因出現特征性的不連續的30個氨基酸（90個堿基）的缺失，針對NSP2設計引物，建立了快速診斷高致病性PRRSV的實時熒光定量RT-PCR檢測技術，來區分高致病性藍耳病毒和經典北美型藍耳病毒。與常規的RT-PCR方法相比，該法設計了熒光探針，增強了檢測的特異性，具有操作方便、結果直觀、敏感性高、重復性好等優點，有廣泛的應用前景。

3.血清中和試驗。SN在PRRS抗體檢測中特異性高，可用于免疫效果的評價。SN檢測時抗體比IFA出現晚，而不適宜于急性感染性的抗體。SN在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的方法都要以此為標準進行比較。本法操作復雜，僅限于實驗室研究應用，不適合大規模推廣適用。SN是中華人民共和國國家標準規定用于檢測PRRS病毒抗體的方法。

4.免疫過氧化酶單層細胞試驗。IPMA于1994年由荷蘭中央獸醫研究所建立，是最早問世的檢測PRRS抗體的血清學方法。該法主要在CL-2621及Marc-l45培養物上進行，可用于PRRSV的抗原檢測、病毒鑒定及早期血清抗體檢測。IPMA能從感染后7～15 d的豬體中檢測到PRRS抗體，敏感性和特異性較好。IPMA的不足之處是實驗結果可能受實驗毒株和感染野毒株相關性的影響，且IPMA的檢測結果需要用肉眼判斷，存在一定的主觀性。IPMA是中華人民共和國國家標準規定用于檢測PRRS抗體的方法，多用于確定病性而不易區分病毒的抗原類型。

5.間接免疫熒光抗體試驗。IFA是應用抗原抗體反應原理及異硫氰酸熒光素（FITC）標記二抗，建立檢測PRRSV抗體的方法。1992年由美國Yoon等首次建立IFA，該法具有較好的敏感性和特異性，已廣泛應用于北美實際檢測中。1996年我國哈爾濱獸醫研究所首次建立了IFA的檢測方法。1997年孫穎杰等報道建立了微量IFA法檢測PRRSV抗體，和美國的玻片IFA特異性敏感性相同，符合率達到100%。針對臨床上新近感染PRRSV的樣品易使用IFA試驗，操作快速簡單，檢測成本低，與IPMA具有相同的特異性和敏感性。IFA是中華人民共和國國家標準規定用于檢測PRRS的病毒抗體的方法，在許多國家都得到了廣泛應用，已成為各國官方認可的檢測方法之一。

6.間接酶聯免疫吸附試驗。間接ELISA主要用于檢測動物感染PRSSV之后的抗體水平。1992年國外學者Albnia等應用PAM細胞培養制備病毒抗原，首次建立了檢測PRRVS抗體的間接ELISA。1996年Takikawa等用PRRSV接種Marc-145制備抗原，改進了檢測PRRSV抗體的ELISA方法，我國也在1996年建立了ELISA檢測方法。國內外學者在PRRSV 抗體ELISA 試劑盒的研發上做了大量研究，已有用核衣殼蛋白（N蛋白）或用膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作為主要包被抗原檢測PRRSV抗體的間接ELISA試劑盒面世。國外的ELISA試劑盒具有良好的特異性、敏感性和可重復性，常被一些權威部門用于PRRS抗體檢測，由于此類產品價格昂貴，限制了在臨床上的應用。國內學者研發的PRRS抗體檢測試劑盒在靈敏度和試劑盒保存條件等方面還有待提高。2006年吳延功等以純化的重組N蛋白為包被抗原，建立PRRSV的檢測方法，同時使用國外的試劑盒對899份樣品進行檢測，結果表明兩種方法的符合率是91.73%。ELISA方法因具備穩定性好、抗原用量少、特異性強、結果便于長期保存等優點，現已廣泛用于PRRSV樣品的臨床檢測，但存在出現假陽性結果的缺點。間接ELISA是中華人民共和國國家標準規定用于檢測PRRS抗體的方法，和IFA、IPMA的特異性相似，但以間接ELISA的的敏感性最高。

四、PRRSV實驗室檢測時要注意的事項

正確選擇樣品及時送檢，采集的樣品最好是處于急性感染期，后期采集的樣品易產生陰性或可疑結果；血清學結果的判定要慎重，因一部分注射疫苗的豬體內可以檢測到病毒，診斷時需要了解豬群的發病史和疫苗接種時間；診斷PRRSV時最好是抗原和抗體檢測法相結合，因血清學方法無法確定豬群感染的時間，無法區分血清學的陽性結果是由于野毒感染還是接種疫苗所引起；進行病毒分離和RNA檢測的樣品，必須在采集后立即冷藏保存并在2 d內送往診斷實驗室，避免反復凍融。

五、PRRSV實驗室診斷方法的優劣

當前我國豬群中PRRSV的感染率呈逐年上升的趨勢，PRRSV的多樣性、復雜性加大了該病毒防控的難度。因PRRSV幾乎不能從根本上消除，所以重點應放在加強對PRRSV檢測和防治上。上述幾種PRRSV實驗室檢測方法中，分子生物技術敏感性高，特異性強，快速簡便，是目前應用較廣泛的PRRSV檢測技術。IFA、IPMA、SN等技術需要細胞培養、工作量大，多用于科研。ELISA是具有特異性高、一次檢測樣品多、敏感性強，檢測速度快等優點，是目前應用最廣、發展最快的免疫檢測技術，適合大規模流行病調查和大批樣品的檢測，所以很多國家都將其列為標準的操作方法。

總之，PRRSV的流行現狀給疾病診斷帶來了巨大的挑戰，在實際生產中應根據不同的需要選擇合適的診斷方法。一般VI、SN、IFA和IPMA不適于實際生產推廣和應用，分子生物學診斷技術RT-PCR更受實驗室的青睞，間接ELISA的靈敏度高、特異性強，多用于PRRS的臨床診斷。

參考文獻圖（略）