農(nóng)業(yè)院校高水平運(yùn)動員腸道菌群區(qū)系與身體素質(zhì)的關(guān)系探討

劉志剛,馮海峰,莊俊濤,劉勉

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)體育與藝術(shù)學(xué)院,山東泰安271018

農(nóng)業(yè)院校高水平運(yùn)動員腸道菌群區(qū)系與身體素質(zhì)的關(guān)系探討

劉志剛,馮海峰,莊俊濤,劉勉

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)體育與藝術(shù)學(xué)院,山東泰安271018

為研究農(nóng)業(yè)院校高水平運(yùn)動員腸道菌群區(qū)系與身體素質(zhì)的關(guān)系，解決運(yùn)動性胃腸綜合征問題，提高運(yùn)動員的競技水平，通過采集山東農(nóng)大不同來源運(yùn)動員的新鮮糞樣，對胃腸道正常菌群進(jìn)行分離鑒定，并對分離的優(yōu)勢菌乳酸桿菌進(jìn)行16 SrRNA分析；同時將正常菌群優(yōu)勢菌研制成口服液，安全性檢測合格后用于受試者，連續(xù)服用10 d，每日1次，觀察運(yùn)動員胃腸道菌群的變化及其與身體素質(zhì)的關(guān)系。結(jié)果表明：運(yùn)動員腸道中的優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌、雙歧桿菌、消化球菌和腸球菌，且異性之間腸道正常菌群平均值差異顯著（P＜0.05），同性不同區(qū)域之間差異不顯著（P＞0.05）；對4株乳酸桿菌嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus、卷曲乳桿菌Lactobacillus crispatus、鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus和唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius16SrRNA檢測分析，并與Genbank上公布的序列分析，同源性分別為99.2%，99.1%，99.8%和98.9%。受試運(yùn)動員服用微生態(tài)制劑后，胃腸功能、運(yùn)動持久力、抗感冒的能力均明顯增強(qiáng)，抗疲勞能力增強(qiáng)0.7～1.1 h。由此可見運(yùn)動員腸道菌群區(qū)系與身體素質(zhì)關(guān)系密切，堅持服用微生態(tài)制劑可以明顯提高運(yùn)動員的運(yùn)動能力，解決運(yùn)動性胃腸綜合征問題，為提高運(yùn)動員的水平提供理論依據(jù)。

農(nóng)業(yè)院校;運(yùn)動員;腸道;正常菌群;微生態(tài)制劑;身體素質(zhì)

人體是一個復(fù)雜的有機(jī)體，各個功能系統(tǒng)之間都是相輔相成，密切聯(lián)系的。應(yīng)激反應(yīng)是不斷變化的外界條件所引起的機(jī)體功能狀態(tài)的適應(yīng)性變化。在某種意義上，人體的胃腸道也是控制和調(diào)節(jié)運(yùn)動員適應(yīng)和再生能力系統(tǒng)的一部分。平衡的胃腸免疫系統(tǒng)以及積極的免疫活性可以使運(yùn)動員抵御有害病原體的侵害。在運(yùn)動過程中，機(jī)體所發(fā)生的一系列的變化將會導(dǎo)致胃腸系統(tǒng)的功能及其結(jié)構(gòu)的變化，降低胃腸道對體液及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致脫水和能量貯存不足，從而影響運(yùn)動員的運(yùn)動能力。

近年來，隨著高校高水平運(yùn)動員的增多，鍛煉項(xiàng)目及鍛煉強(qiáng)度的增加，運(yùn)動員常常出現(xiàn)運(yùn)動后身體不適，尤其是胃腸功能的問題[1]。人們己經(jīng)很多地了解到有關(guān)體育運(yùn)動對心肺功能及內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，而體育運(yùn)動與胃腸微生物區(qū)系的關(guān)系卻知之甚少。胃腸道微生物對維持人類健康起著重要作用，而且與胃腸綜合征的發(fā)病有著一定的聯(lián)系[2,3]。經(jīng)常從事體育鍛煉，對胃腸道的機(jī)能有良好影響，可以使胃腸的蠕動增強(qiáng)，消化液的分泌增多，因而提高了消化和吸收的能力，使人的食欲增加，有利于增強(qiáng)體質(zhì)。但是，劇烈的緊張性運(yùn)動則會導(dǎo)致胃腸功能紊亂，引起嘔吐、腹瀉等不良癥狀，這在運(yùn)動員，尤其是耐力運(yùn)動員中尤為常見。運(yùn)動員腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究將會給運(yùn)動性胃腸綜合征發(fā)生機(jī)制的研究提供許多有價值的信息和思路[4-7]。本研究以山東農(nóng)業(yè)大學(xué)高水平運(yùn)動員為研究對象，目的在于探索高水平運(yùn)動員胃腸道微生物區(qū)系與人體素質(zhì)的關(guān)系，解決運(yùn)動性胃腸綜合征問題，為提高運(yùn)動員的水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（WS2-134-65,HH B11 420），上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠生產(chǎn)；厭氧菌培養(yǎng)箱（YQX-II），上海康華生化儀器制造廠生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS,CH-2），JAPAN生產(chǎn)；電子天平(asleep EY-300A),JAPAN生產(chǎn)；微量移液器，德國Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑

革蘭氏染色液，微量生化反應(yīng)管，上海醫(yī)學(xué)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；FS、ES、PS、BLb、MRS、BDS、EC、SP、Emb等培養(yǎng)基購自天津東方衛(wèi)生材料廠；硝酸鹽還原培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基購自上海生物工程公司。

1.3 運(yùn)動員胃腸道正常菌群的分離鑒定

采用隨機(jī)抽樣的方法，抽取山東農(nóng)大高水平運(yùn)動員40名(其中男女各20名)，在其訓(xùn)練前，分別采集1克新鮮糞樣，按常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌分離并鑒定。

1.4 運(yùn)動員胃腸道微生物優(yōu)勢菌16SrRNA分析

采用隨機(jī)抽樣的方法，抽取山東農(nóng)大運(yùn)動員(其中男女各10名)，在其訓(xùn)練前后，分別采集1 g新鮮糞樣，并對樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取細(xì)菌總DNA，以細(xì)菌總DNA為模板，16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL，即ddH2O 16 μL、10×buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、上下游引物各0.5 μL(引物濃度為25 pmol/μL)、模板1.0 μL、酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入94℃變性30 s、56.0℃退火30 s和72℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，重組質(zhì)粒鑒定為陽性的送南京金斯瑞科技有限公司測序，將所得到的序列與Genbank中的16S rDNA序列進(jìn)行分析比較。

1.5 益微生態(tài)制劑對運(yùn)動員身體素質(zhì)的增強(qiáng)作用

將分離獲得的胃腸道正常菌群通過比較分析，篩選優(yōu)勢菌株，經(jīng)一定工藝研制成微生態(tài)制劑口服液。為了確定受試運(yùn)動員服用微生態(tài)制劑口服液的胃腸功能、運(yùn)動持久力（抗疲勞能力）、抵抗感冒能力，由教練制定訓(xùn)練計劃，使受試者完成定量的運(yùn)動負(fù)荷，通過對照服用微生態(tài)制劑前后，受試者對同樣強(qiáng)度的疲勞運(yùn)動負(fù)荷一系列生理生化反應(yīng)，觀察微生態(tài)制劑口服液的抗疲勞效果，試驗(yàn)組受試者服用10 d微生態(tài)制劑，每日1次，午餐前服用，比較服用微生態(tài)制劑前后同一組運(yùn)動員的身體素質(zhì)的變化。

2 結(jié)果

2.1 高水平運(yùn)動員腸道菌群鑒定結(jié)果

2.1.1 選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征觀察選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征（見圖1），結(jié)合楊景云(1997)報道的鑒定方法，根據(jù)各菌落的特征初步對其菌屬進(jìn)行確定，結(jié)果見表1。

2.1.2 選擇性培養(yǎng)基上細(xì)菌的形態(tài)特征挑取選擇性培養(yǎng)基上目的菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察，參考東秀珠（2001）的鑒定方法，對挑取細(xì)菌的形態(tài)特征進(jìn)行對照，進(jìn)一步對菌屬進(jìn)行確定，結(jié)果見表2。

圖1 各種細(xì)菌在選擇性培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)Fig.1 Colony morphology of bacteria on selective medium

表1 各選擇性培養(yǎng)基上菌落的特征Table 1 Colony characteristics of bacteria on seclective medium

表2 選擇性培養(yǎng)基上細(xì)菌的形態(tài)特征Table 2 Characteristics of bacteria on seclective medium

2.1.3 選擇性培養(yǎng)基上細(xì)菌的生化特征將選擇性培養(yǎng)基上分離到的各種細(xì)菌純培養(yǎng)之后，分別進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 各種細(xì)菌的主要生化特征Table 3 The main biochemical characteristics of various bacteria

2.2 不同來源運(yùn)動員糞便中正常菌群的數(shù)量

對抽取的山東農(nóng)大運(yùn)動員來自農(nóng)村和城市男女各10名，檢測的正常菌群的數(shù)量見表4。

表4 不同來源運(yùn)動員糞便中正常菌群的數(shù)量(nlog10/g糞樣)Table 4 The number of normal flora in feces of different athletes(nlog10/g feces)

由表4分析，運(yùn)動員腸道中的優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌、雙歧桿菌、消化球菌和腸球菌；運(yùn)動員腸道正常菌群經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析10名來自城市的男運(yùn)動員平均值與10名來自城市的女運(yùn)動員平均值及10名來自農(nóng)村的女運(yùn)動員平均值差異顯著（P＞0.05），與10名來自農(nóng)村的男運(yùn)動員平均值差異不顯著（P〉0.05）；10名來自農(nóng)村的男運(yùn)動員腸道正常菌群平均值與10名來自城市的女運(yùn)動員平均值及10名來自農(nóng)村的女運(yùn)動員平均值差異顯著（P＞0.05）。

2.3 運(yùn)動員胃腸道優(yōu)勢菌16SrRNA結(jié)果

2.3.1 分離菌的16S rRNA鑒定結(jié)果由圖2表明，1～4菌株的16S rRNA基因序列長度均為1500 bp，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相同。

圖2 分離菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增圖Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA geneM:Marker，1-4為SL-1、SL-2、SL-3和SL-4分離菌株，5為標(biāo)準(zhǔn)株（LB1）M:Marker;1-4 Lactobacilli isolate SL-1,SL-2,SL-3,SL-3 and SL-4; 5:Standard Lactobacilli DNA sample（LB1）

2.3.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果將PCR產(chǎn)物測序，并在Genbank上進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示，SL-1、SL-2、SL-3、SL-4株分別屬于嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）和唾液乳桿菌（L.salivarius），它們的同源性分別為99.2%，99.1%，99.8%和98.9%。

2.4 微生態(tài)制劑口服液對運(yùn)動員身體素質(zhì)的增強(qiáng)作用

由表5可見運(yùn)動員服用10 d后胃腸功能、運(yùn)動持久力、抗感冒的能力明顯增強(qiáng)，能更好的適應(yīng)運(yùn)動帶來的應(yīng)急反應(yīng)，抗疲勞能力增強(qiáng)0.7～1.1 h，僅1例出現(xiàn)感冒現(xiàn)象。

表5 益生菌制劑的研制及其對運(yùn)動員身體素質(zhì)的增強(qiáng)作用Table 5 The development and enhancement on athletes'physical quality of probiotics

3 討論

近年來，隨著全民健身計劃的實(shí)施，體育運(yùn)動已經(jīng)以不同的形式在社會中廣泛流行，尤其是在具有健康意識的群體中。有關(guān)體育運(yùn)動對心肺功能及內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響人們己經(jīng)有了很多的了解，而體育運(yùn)動對胃腸微生物區(qū)系的影響人們卻知之甚少。經(jīng)常從事體育鍛煉，對胃腸道的機(jī)能有良好影響，可以使胃腸的蠕動增強(qiáng)，消化液的分泌增多，因而提高了消化和吸收的能力，使人的食欲增加，有利于增強(qiáng)體質(zhì)。但是隨著體育競技運(yùn)動水平的不斷提高，勢必要求有高水平的運(yùn)動訓(xùn)練。運(yùn)動性胃腸綜合征是運(yùn)動員在高強(qiáng)度、大運(yùn)動量的運(yùn)動訓(xùn)練和比賽中造成的機(jī)體胃腸功能紊亂的現(xiàn)象，而且也不同程度地妨礙了運(yùn)動員正常的運(yùn)動訓(xùn)練和比賽。本研究對抽取的山東農(nóng)大運(yùn)動員腸道的正常菌群進(jìn)行分離鑒定，對定植在胃腸道內(nèi)的正常微生物區(qū)系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動員腸道中的優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌、雙歧桿菌、消化球菌和腸球菌，對其腸道正常菌群進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示男運(yùn)動員腸道正常菌群的平均值顯著高于女運(yùn)動員平均值，可見性別不同的運(yùn)動員腸道正常菌群的平均值差異顯著；10名來自城市的男運(yùn)動員腸道正常菌群平均值與10名來自農(nóng)村的男運(yùn)動員腸道正常菌群平均值，以及10名來自城市的女運(yùn)動員腸道正常菌群平均值與10名來自農(nóng)村的女運(yùn)動員腸道正常菌群平均值差異不顯著（P＞0.05），可見地區(qū)來源不同的運(yùn)動員平均值差異不顯著（P＞0.05）；10名來自城市的女運(yùn)動員平均值與10名來自農(nóng)村的女運(yùn)動員平均值差異顯著（P＜0.05）。

近年來，隨著微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，人們注意到定植在胃腸道內(nèi)微生物菌群區(qū)系結(jié)構(gòu)，這個區(qū)系主要是由許多細(xì)菌組成，它們附著在腸內(nèi)粘膜上，參與了機(jī)體的食物消化、藥物代謝、合成維生素和防止外源致病菌入侵腸道，對于維持人類的健康和實(shí)現(xiàn)各種生理功能起著非常重要的作用。人體腸道內(nèi)這些微生物與人體胃腸的功能關(guān)系密切[5,7,8]。在研究運(yùn)動員胃腸功能的變化時，胃腸道的微生物區(qū)系是不容忽視的因素[8,9]。通過運(yùn)動員口服微生態(tài)制劑來研究微生態(tài)制劑對運(yùn)動員身體素質(zhì)的增強(qiáng)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)大學(xué)運(yùn)動員口服微生態(tài)制劑后明顯增強(qiáng)了運(yùn)動員的抗應(yīng)急、抗疲勞、抗感冒的能力，可見運(yùn)動員腸道菌群區(qū)系與身體素質(zhì)關(guān)系密切，堅持服用微生態(tài)制劑可以明顯提高運(yùn)動員的運(yùn)動能力。這一研究結(jié)果不僅有助于解決運(yùn)動性胃腸綜合征問題，進(jìn)一步闡明運(yùn)動性胃腸綜合征的發(fā)病機(jī)制，了解和掌握運(yùn)動中胃腸功能變化的規(guī)律，科學(xué)地指導(dǎo)體育訓(xùn)練，促進(jìn)我國競技體育的發(fā)展，而且還將為我國全民健身計劃的開展實(shí)施提供科學(xué)的指導(dǎo)依據(jù)。

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The Exploration for the Relationship between Intestinal Flora and Physical Quality of the High-level Athletes in Agricultural Universities

LIU Zhi-gang,FENG Hai-feng,ZHUANG Jun-tao,LIU Mian
Sports and Art College of Shandong Agricultural University,Taian271018,China

For studying Agricultural universities’high-level athletes intestinal flora fauna and physical relationship,solving the problem of gastrointestinal motility syndrome,improving the competitive level of athletes,we collect the fresh fecal samples of athletes from Shandong Agricultural University to isolate and identify the normal flora of the gastrointestinal tract. Lactobacillus,the normal flora dominant bacteria are conducted for 16SrRNA analysis and developed into oral liquid.After safety testing,it used to subjects,taking for 10 days,once a day before lunch,observe the relationship between the changes in athletes’gastrointestinal flora and their physical quality.The results show that the dominant flora in athletes’intestinal are Lactobacillus,Bifidobacterium,Peptococcus and Enterococcus,and the average of normal intestinal flora between heterosexual has a significant difference(P＞0.05),but the difference between different regions of the same sex is not significant(P＞0.05).The four strains ofLactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus rhamnosusandLactobacillus salivariusare conducted for 16SrRNA detection and analysis and compare with the sequence in Genbank:the homology are 99.2%,99.1%,99.8%and 98.9%.After taking probiotics,the gastrointestinal function,exercise endurance and the ability to anti-cold of tested athletes are all enhanced significantly.Besides,the resistance to fatigue is enhanced for0.7-1.1 h.Those show that the intestinal flora fauna of athletes and their physical quality have a close relation.Insisting on taking probiotics can improve the athletes’athletic ability significantly and solve the problem of gastrointestinal motility syndrome.Besides,it can provide a theoretical basis for improving the level of athletes.

Agricultural universities;athletes;intestinal tract;normal flora;probiotics;physical quality

R378.2

:A

:1000-2324(2015)06-0874-06

2013-04-11

:2013-04-25

山東星火計劃項(xiàng)目(2008XH080)

劉志剛(1958-),男,副教授,研究方向?yàn)殛柟怏w育及足球運(yùn)動.E-mail:yh1368@sdau.edu.cn