Fogarty球囊構建兔頸總動脈損傷及移植內皮祖細胞治療的動物模型

許榮睿，趙國峰，丁蓉蓉，李英豪，秦永林，趙登玲，金暉，鄧鋼

(東南大學附屬中大醫院 介入與血管外科，江蘇省分子影像與功能影像重點實驗室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

Fogarty球囊構建兔頸總動脈損傷及移植內皮祖細胞治療的動物模型

許榮睿，趙國峰，丁蓉蓉，李英豪，秦永林，趙登玲，金暉，鄧鋼

(東南大學附屬中大醫院 介入與血管外科，江蘇省分子影像與功能影像重點實驗室，江蘇 南京 210009)

目的:利用Fogarty球囊建立兔頸總動脈球囊損傷及損傷處移植內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPCs)治療的動物模型。方法:培養兔外周血中EPCs并以Fe2O3磁性納米顆粒標記。將實驗兔隨機分為細胞組(12只)和空白組(10只)，經股動脈入路利用Fogarty球囊損傷兩組兔右側頸總動脈，并用Fogarty球囊阻斷血流后將標記EPCs移植至細胞組血管損傷段，將生理鹽水注入空白組；術后7d取2只細胞組兔損傷血管行普魯士藍染色；術后3d,1、4、8周行MR掃描；術后8周取損傷血管，行HE、彈力纖維及PCNA染色。結果:術后7d普魯士藍染色示損傷內膜可見含鐵EPCs附著，MR掃描示術后4周空白組兔損傷血管壁稍有增厚，術后8周明顯增厚，細胞組術后4周損傷血管管壁未見明顯增厚，8周后稍有增厚。病理學檢查示，術后8周細胞組與空白組內膜/中膜比(N/M)分別為0.34±0.05和1.14±0.10(P<0.01)，PCNA陽性細胞指數為0.08±0.01和0.31±0.01(P<0.05)。結論:Fogarty球囊成功構建兔頸總動脈損傷狹窄模型并阻斷血流實現EPCs定向移植至血管損傷處，參與內膜的修復。

Fogarty球囊； 球囊損傷； 再狹窄； 內皮祖細胞

周圍動脈疾病發病率逐年增高，經皮腔內血管成形術(percutaneous transluminal angioplasty， PTA)以其微創及并發癥低的優勢而廣泛用于周圍血管疾病的治療，但遠期通暢率不理想，術后再狹窄成為臨床急待解決的問題[1]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells， EPCs)是成熟血管內皮細胞的前體細胞，能夠定位于受損血管部位，維持血管內皮單細胞層的完整性，抑制血栓形成，從而抑制血管損傷后再狹窄[2-3]。建立PTA術后再狹窄的動物模型，是進一步研究PTA術后的再狹窄機制和預防治療的基礎。本實驗模擬臨床介入治療路徑，通過股動脈入路應用Fogarty球囊構建兔頸總動脈損傷及損傷局部移植EPCs治療的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性新西蘭大白兔22只(南京金陵種兔場)，體重3.0～3.5kg，隨機分為細胞組(n=12)和空白組(n=10)。

1.2 主要試劑及設備

EGM-2培養基(Lonza，美國)，人纖維粘連蛋白(Chemicon，美國)，淋巴細胞分離液(達科為)，3F雙腔Fogarty球囊導管(Edwards LIfesciences)，0.035超滑導絲(Terumo公司，日本)，3.0T MR(Simens公司，德國)，彈力纖維染色試劑盒(邁新生物)，PCNA染色試劑盒(邁新生物)，Fe2O3磁性納米顆粒(東南大學生物科學與醫學工程學院)。

1.3 實驗方法

1.3.1兔外周血EPCs的分離培養 兔外周血EPCs分離培養的方法詳見文獻[4]。將Fe2O3納米磁顆粒加入第3代(約18d)EPCs的培養液中進行標記，使鐵終濃度為25μg·ml-1，體積分數為5% CO2、37℃培養箱中繼續培養24h后取部分細胞加入六孔板中，利用普魯士藍染色觀察體外細胞鐵標記情況，余用于細胞移植。

1.3.2兔頸總動脈損傷及損傷處移植EPCs治療模型的制作 兔全麻成功后固定于手術臺，分離右側股動脈，Seldinger法成功穿刺右側股動脈后引入Fogarty球囊并選入右側頸總動脈，充盈球囊損傷血管(充盈球囊直徑∶正常動脈直徑比值為1.2∶1.0，保留球囊壓力，來回拖拉3次，每次1min)，損傷后造影見損傷血管明顯擴張，于頸總動脈損傷段下端充盈Fogarty球囊阻斷局部血流，經球囊導管注入含1×106ml-1EPCs的細胞懸液5ml，分5次注射，每次1ml，持續5min后緩慢恢復血流，間隔數分鐘，重復上述操作。空白組注入等量生理鹽水。

1.3.3MR檢查 兩組動物術后3d，1、4、8周分別隨機選取2只行MR檢查。全麻后固定于3.0T MR檢查床，行T1WI、T2WI、PDWI等序列掃描。

1.3.4組織病理學檢查 術后8周處死動物，取其頸動脈標本，固定后石蠟包埋，血管橫斷面切片，行HE染色，觀察新生內膜增生程度，利用Image J軟件分析測量各組標本血管切片內膜、中膜厚度及其比值(N/M)；行PCNA染色，觀察平滑肌細胞增殖情況，每張切片用光學顯微鏡在高倍鏡下隨機選取6個視野，分別計數每個視野下血管內膜中血管平滑肌細胞總數及PCNA陽性細胞數(呈棕色顆粒狀著色)，求百分比，取平均值即為內膜PCNA陽性細胞指數即平滑肌細胞增殖指數。行彈力纖維染色，觀察彈力纖維增生情況。

1.4 統計學處理

數據采用SPSS19.0統計軟件進行分析，使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體外細胞鐵標記

普魯士藍染色示Fe2O3納米磁顆粒標記細胞內均可見藍色顆粒(圖1)，標記率近100%。

圖1 體外標記細胞普魯士藍染色結果 ×100

Fig 1 Prussian blue staining of EPCs labeled by Fe2O3invitro(×100)

2.2 球囊損傷及細胞移植模型制作

Fogarty球囊成功選入右側頸總動脈，充盈球囊來回拖動損傷兔右側頸總動脈(圖2a)；損傷后路徑圖見右側頸總動脈較左側明顯擴張(圖2b)；于頸總動脈損傷段下端充盈Fogarty球囊并阻斷局部血流，經Fogarty球囊導管注入EPCs或等量生理鹽水(圖2c)。

圖2 球囊損傷及細胞移植模型制作DSA圖

Fig 2 DSA images of animal model with injury and EPCs transplantation

2.3 MR掃描及病理學檢查

頸總動脈損傷后7d，行普魯士藍染色示移植細胞后的損傷血管段可見藍色顆粒狀含鐵EPCs附著于內膜，未損傷的左側頸總動脈內膜未見含鐵EPCs附著。見圖3。

頸總動脈損傷后3d、1周行MR掃描，對照左側，術后3d右側頸總動脈擴張損傷血管段仍擴張，且損傷血管壁增厚水腫，PDWI呈高信號改變，T1WI低信號(圖4a、b)，術后1周損傷血管修復增生，管腔擴張已不明顯，兩側頸總動脈直徑相仿，血管壁周圍水腫減輕(圖4c、d)。

兔頸總動脈損傷后4、8周行MR掃描，術后4周對照左側，細胞組右側頸總動脈損傷段管壁未見明顯增厚，管腔未見明顯狹窄(圖5a、b)。空白組右側血管壁可見稍有增厚，血管腔不光滑(圖5c、d)。術后8周對照左側，細胞組右側頸總動脈管壁可見輕度增厚，管腔稍有狹窄(圖6a、b)，空白組血管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄(圖6c、d)。

術后8周切片HE、彈力纖維及PCNA染色示，空白組右側頸總動脈損傷段血管內膜明顯增厚，管壁增厚，新生內膜內彈力纖維大量增生(彈力纖維呈紫色)，新生內膜內見棕色顆粒狀平滑肌細胞增殖。細胞組內膜及彈力纖維增生程度明顯減輕，新生內膜中棕色顆粒狀平滑肌細胞增殖數量明顯減少。未損傷左側頸總動脈內皮細胞完整，內彈力板完整，中膜平滑肌細胞呈梭形排列整齊。見圖7～9。

a.未損傷的左側頸總動脈； b.損傷后移植EPCs右側頸總動脈

圖3 普魯士藍染色結果 ×400

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery

Fig 3 Prussian blue staining(×400)

a.術后3d MR PDWI序列成像； b.術后3d MR T1WI序列成像； c.術后7d MR PDWI序列成像； d.術后7d MR T1WI序列成像

圖4 頸總動脈MR橫斷面平掃

a.MR PDWI on the 3rd day after injure; b.MR T1WI on the 3rd day after injure； c.MR PDWI on the 7th day after injure； d.MR T1WI on the 7th day after injure

Fig 4 MR axial scan of the common carotid artery

a.MR PDWI序列成像； b.MR T1WI序列成像； c.MR PDWI序列成像; d.MR T1WI序列成像

圖5 頸總動脈MR橫斷面平掃(術后4周)

a.MR PDWI; b.MR T1WI; c.MR PDWI; d.MR T1WI

Fig 5 MR axial scan of the common carotid artery(the 4th week after injure)

a.MR PDWI序列成像； b.MR T1WI序列成像； c.MR PDWI序列成像； d.MR T1WI序列成像

圖6 頸總動脈MR橫斷面平掃(術后8周)

a.MR PDWI; b.MR T1WI; c.MR PDWI; d.MR T1WI

Fig 6 MR axial scan of the common carotid artery(the 8th week after injure)

a.左側未損傷頸總動脈； b.空白組損傷后的右側頸總動脈； c.細胞組損傷后的右側頸總動脈

圖7 術后8周目標血管HE染色結果 ×200

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery of the blank group; c.The injured right commom carotid artery of the cell group

Fig 7 HE stain of target vessel(the 8th week after injured，×200)

a.左側未損傷頸總動脈； b.空白組損傷后的右側頸總動脈； c.細胞組右側頸總動脈

圖8 術后8周彈力纖維染色結果 ×200

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery of the blank group; c.The injured right commom carotid artery of the cell group

Fig 8 Elastic tissue stain of target vessel (the 8th week after injured，×200)

a.左側未損傷頸總動脈； b.空白組損傷后的右側頸總動脈； c.細胞組損傷后的右側頸總動脈

圖9 術后8周PCNA染色結果 ×200

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery of the blank group; c.The injured right commom carotid artery of the cell group

Fig 9 PCNA stain of target vessel(the 8th week after injured，×200)

2.4 兩組損傷血管N/M值及PCNA指數比較見表1、2。

3 討 論

PTA術后再狹窄的主要機制是球囊擴張或支架植入治療中引起血管內膜的機械性損傷導致內皮細胞損傷，血管內皮功能不全，引起血管壁血栓、炎癥、平滑肌細胞增殖及細胞外基質改變等一系列病理生理學改變，導致再狹窄形成[5]。因此，內皮細胞損傷是PTA術后再狹窄的始動因素，PTA術后盡早促進損傷血管段內皮化，對于防止再狹窄的發生至關重要。自1997年EPCs被Asahasa等[6]發現以來，因其在血管損傷后的內皮修復和血管形成中的重要作用而備受關注。

注：術后8周兩組間N/M值差異有統計學意義，P<0.01

注：術后8周兩組間PCNA指數差異有統計學意義，P<0.05

本實驗采用新西蘭大白兔成功地經股動脈入路制作了頸動脈狹窄的動物模型。而既往采用直視下切開頸動脈后置入球囊進行球囊成形造模，與臨床介入治療頸動脈狹窄的路徑不一致。在本實驗中動物模型的制作基本模擬了臨床介入治療途徑，利用Fogarty球囊經股動脈入路行頸動脈PTA 在DSA下根據頸動脈的管徑采取定比(1.2∶1)擴張，通過MR掃描發現空白組兔右側頸總動脈損傷血管段術后3d仍呈擴張狀態，術后1周血管修復增生，4周后管壁稍增厚，管腔稍狹窄，8周后管腔明顯狹窄，病理學檢查顯示血管內膜、彈力纖維及平滑肌細胞明顯增生，成功地模擬了PTA術后血管內皮損傷后的病理過程。且本實驗采用Fogarty球囊，損傷后可阻斷血流，將EPCs定向移植至血管損傷處，提高了EPCs的黏附率。較Cao等[7]通過大鼠尾靜脈注入EPCs及Ma等[8]通過夾閉兔頸總動脈阻斷血流后局部注射EPCs等方法，此方法細胞的移植效率更高，操作更為簡易，微創，成功率更高，術后死亡率更低。術后通過MR及病理學檢查顯示，Fogarty球囊阻斷血流能夠有效地將EPCs移植至血管損傷處，抑制平滑肌細胞的增殖修復損傷內膜。

本研究成功應用Fogarty球囊構建兔頸總動脈損傷狹窄模型并實現EPCs定向移植至血管損傷處，參與局部損傷內膜的修復，為進一步研究血管成形術后局部移植細胞或注射藥物預防再狹窄提供了技術基礎。

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Construction of rabbit carotid artery balloon injury model with local transplantation EPCs to the injury by the Fogarty balloon

XU Rong-rui，ZHAO Guo-feng，DING Rong-rong，LI Ying-hao，QIN Yong-lin，ZHAO Deng-ling，JIN Hui，DENG Gang

(DepartmentofInterventionalandVascularSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，JiangsuKeyLaboratoryofMolecularImagingandFunctionalImaging，Nanjing210009，China)

Objective： To establish rabbit carotid artery balloon injury model with transplanting endothelial progenitor cells (EPCs) to the injury region by the Fogarty balloon. Methods: EPCs were isolated from rabbit peripheral blood and were incubated with Fe2O3-arginine. Rabbits were randomly divided into cell group(n=12) and blank group(n=10). The Fogarty balloon catheter was induced into the right common carotid artery(CCA) through the right femoral artery， and then blocking blood flow to transplant EPCs and equal amount of normal saline to the balloon injury local via Fogarty balloon in the cell and blank group respectively. Two rabbits in cell group were killed and the injured vessels for Prussian blue staining on 7rd day. MR was performed on 3rd day， 1th， 4th and 8th week after transplantation. The injured vessels for HE， elastic tissue and PCNA staining on 8th week after injury. Results: Prussian blue staining showed iron-labeled cells distributed in the injured endothelium. In blank group， MR showed the injured arterial wall slightly thickened at 4th week after injury， and more obvious with severe stenosis in the lumen at 8th week; In cell group， the injured arterial wall barely thickened at 4th week and slightly thickened at 8th week. The pathological study showed， the neointimal/media ratio(N/M) in cell group and blank group was 0.34±0.05 and 1.14±0.10， respectively(P<0.01); the PCNA positive cell index in cell group and blank group was 0.08±0.01 and 0.31±0.01， respectively(P<0.05)， on 8th week after injury. Conclusion: The Fogarty balloon can be used to establish rabbit carotid artery balloon injury model， followed by local transplantation EPCs to the injury region.

Fogarty balloons; balloon injury; restenosis; endothelial progenitor cells

2015-01-29

2015-03-22

國家自然科學基金資助項目(81171433/H1816)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(2242015K40009)

許榮睿(1990-)，女，安徽滁州人，在讀碩士研究生。E-mail：njxurongrui@163.com

鄧鋼 E-mail：dmm1996@163.com

許榮睿,趙國峰,丁蓉蓉,等.Fogarty球囊構建兔頸總動脈損傷及移植內皮祖細胞治療的動物模型[J].東南大學學報:醫學版,2015,34(4)：582-587.

R-332； R654.3； R543.4

A

1671-6264(2015)04-0582-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．018